SARS相關(guān)冠狀病毒Spike蛋白定點突變和細胞融合報導系統(tǒng)載體構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、SARS-CoV是正義單鏈病毒,基因組全長約為29.7kb。它是一種與之前所報道的各種冠狀病毒不同的新的病毒,是引起2002-2003年全球爆發(fā)的人類嚴重急性呼吸綜合癥(SARS)的元兇。 本文主要研究SARS-CoV中的其中一個結(jié)構(gòu)蛋白——刺突蛋白(S)。在SARS-CoV引起的細胞膜融合過程中,S蛋白起著至關(guān)重要的作用。S蛋白與受體的結(jié)合親和力如何,直接決定病毒對靶細胞的感染活性,同時S蛋白也是SARS-CoV的一個重要的抗

2、原位點,針對這一抗原位點的深入研究可以為疫苗研究尋求有效的靶點奠定堅實的基礎(chǔ)。本研究根據(jù)對SARS不同來源株的S蛋白的核苷酸多序列的比對,計算其相應位點的突變墑值和突變幾率后,結(jié)合進一步的生物信息學分析(核苷酸和蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)比較、結(jié)構(gòu)域等二級結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)折疊、功能預測等),先從數(shù)十個突變熱點中篩選出經(jīng)預測可能影響S蛋白與其受體結(jié)合進而導致SARS病毒對宿主細胞的膜融合侵染能力的7個位點,參照文獻設計特異性引物和突變引物,利用重疊延

3、伸PCR法(OE-PCR)或直接PCR法進行人工定點突變。 研究中先將S蛋白的讀碼框(ORF)序列利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、PstⅠ、HindⅢ、SalⅠ、Bgl Ⅱ和ClaⅠ切割成五個DNA片段并亞克隆至經(jīng)相同酶切的pSP72中問載體中,針對經(jīng)序列分析確定的7個突變位點,設計突變引物分別進行單個位點的定點突變體的構(gòu)建,獲得相應的突變體,繼而構(gòu)建野生型和突變體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PLNCX2)系統(tǒng)PLNCX2/Spike。

4、 通過以上實驗,已成功獲得了SARS-CoV Spike野生型和七個位點突變型的PLNCX2載體的重組子,可為研究這些突變位點在Spike蛋白與受體結(jié)合中的意義,進而可為闡述Spike蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、揭示Spike蛋白變異與SARS病毒侵入(染)細胞能力的相關(guān)性提供堅實的實驗依據(jù)。研究細胞膜融合蛋白與受體的結(jié)合的方法多用細胞-細胞融合實驗,為了能有效地觀察細胞-細胞融合的效果,建立了T7 RNA聚合酶/T7啟動子載體系統(tǒng)。設計引

5、物從大腸桿菌BL21中擴增T7 RNA聚合酶基因序列,并將后者插入真核表達載體pRc/CMV2中,構(gòu)建質(zhì)粒pRc/CMV2-T7P,作為T7 RNA聚合酶的供體,而T7 RNA聚合酶特異識別的T7啟動子序列則通過人工合成,并插入帶有報告基團——熒光素酶的表達載體pGL3中,構(gòu)建質(zhì)粒pGL3-T7。因為pGL3質(zhì)粒雖然含有熒光素酶序列,但因為缺乏有效的RNA聚合酶,所以不能單獨表達;而RNA聚合酶的作用又必需由pGL3-T7中的T7啟動子

6、啟動。利用將T7 RNA聚合酶的表達序列和T7 RNA聚合酶啟動子分別構(gòu)建于不同的載體中,將兩質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染效應細胞和靶細胞,可以此來觀察兩者之間的融合情況。如果它們有融合,則可表達熒光素酶蛋白,可用熒光素酶底物檢測到,反之則無表達。 本研究已成功構(gòu)建以上載體,并共轉(zhuǎn)染A549細胞和VERO E6細胞,可在細胞裂解液中檢測到熒光素酶蛋白的表達,說明此系統(tǒng)是可用的。構(gòu)建的系統(tǒng)可廣泛應用于細胞與細胞的融合研究中,是一個非常實用的工具系

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