糖皮質(zhì)激素對大鼠原代肝細胞糖原代謝的雙向調(diào)節(jié)作用.pdf

1、本文采用“兩步灌流法”分離大鼠肝細胞，于William's E Medium+10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)肝細胞形態(tài)學變化，全自動生化分析儀檢測培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(Alb)及尿素(Ureal)含量；糖苷酶降解結(jié)合己糖激酶法葡萄糖測定檢測GCs對大鼠肝細胞內(nèi)糖原含量的影響；酶反應動力學分析法檢測GCs對大鼠肝細胞糖原代謝的關鍵酶糖原磷酸化酶和糖原合酶活性的影響；放射免疫分析法檢測GCs對大鼠

2、肝細胞胞內(nèi)cAMP水平的影響；Fluo-3/AM熒光掃描技術檢測GCs對大鼠肝細胞胞漿游離鈣濃度[Ca<'2+>]i的影響。研究工作取得的主要結(jié)果如下： 1．通過形態(tài)學及臺盼藍染色法鑒定，分離的肝細胞胞膜完整，呈球形或橢球形，存活率在90％以上。培養(yǎng)后貼壁牢固，生長狀態(tài)良好，生化檢測培養(yǎng)上清液中LDH、白蛋白、尿素水平顯示，損傷逐漸恢復，合成及分泌功能良好，說明該方法是比較理想的肝細胞培養(yǎng)法，為實驗研究提供了穩(wěn)定的細胞模型平臺。

3、 2．地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細胞24 h，低濃度(10<'-10>-10<'-9>M) GCs可顯著增加肝細胞糖原含量，而較高濃度(10<'-8>-10<'-5>M)則顯著降低肝細胞糖原含量，并呈劑量依賴性。考慮到高濃度GCs細胞毒作用的可能，采用Cell Counting Kit-8法檢測細胞活力，結(jié)果也排除了細胞毒作用可能的影響。 3．以10<'-6>M地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細胞，觀察細胞內(nèi)糖原含量的變化，發(fā)現(xiàn)2 h

4、后地塞米松處理組較對照組細胞內(nèi)糖原含量顯著降低，48 h后逐漸恢復并于72 h后高于對照組。蛋白合成抑制劑放線菌酮不能阻斷地塞米松的降低糖原含量作用(6 h)。 4．以10<'-6>M地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細胞，15 min后細胞內(nèi)糖原磷酸化酶α活性處理組較對照組顯著增高，2 h后逐漸恢復并于6 h及其以后低于對照組，而糖原合酶活性在6 h及24 h顯著降低。 5．以10<'-6>M地塞米松處理原代培養(yǎng)肝細胞，胞內(nèi)cAM

5、P水平在6 h及24 h顯著升高，地塞米松還能在數(shù)秒內(nèi)迅速升高肝細胞[Ca<'2+>]i水平。 以上結(jié)果表明，GCs對大鼠肝細胞的糖原代謝存在雙向調(diào)節(jié)作用，高濃度GCs在相對較短的時間內(nèi)可以通過影響糖原磷酸化酶和糖原合酶活性而使肝細胞內(nèi)糖原含量下降。該作用可能有著非基因組機制的參與，并與GCs快速升高胞內(nèi)游離鈣以及其影響胞內(nèi)cAMP水平有關。 GCs對糖原代謝的作用是雙向的，推測該作用可能在機體應激反應中具有重要的生理意

6、義。GCs因其濃度不同作用有所差別，正常狀態(tài)下GCs能促進肝糖原的合成，而應激狀態(tài)下GCs在增加糖異生的同時促進肝糖原分解以應對機體對葡萄糖的需要。此外，GCs在應激的不同階段也可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。在強烈應激的早期階段，GCs可能促使儲備的肝糖原分解，而其后GCs促進糖原合成補充急性消耗的肝糖原以防備下次應激。 因此，本研究對GCs在糖代謝中的作用提出了新的模式，為研究GCs特別是其非基因組機制在應激中的生理意義提供了參考依