小鼠播散性巨細(xì)胞病毒感染的免疫應(yīng)答和致病機(jī)制研究-1)小鼠脾巨噬細(xì)胞DNA感受器AIM2識(shí)別MCMV DNA激活其炎性體通路的整體研究;2)Th17細(xì)胞在急性播散性 MCMV感染致病機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：
　　1)在整體水平觀察小鼠MCMV感染后脾巨噬細(xì)胞內(nèi) AIM2炎性體各組分蛋白及其下游促炎因子 IL-1β和IL-18的時(shí)序性表達(dá)變化,證實(shí) AIM2對(duì) MCMV DNA的識(shí)別并探討其炎性體通路在抗 MCMV天然免疫與獲得性免疫機(jī)制中的作用;
　　2)在整體水平觀察 MCMV播散性感染急性期脾 Th17細(xì)胞的分化及其細(xì)胞因子IL-17A在不同臟器內(nèi)的表達(dá)變化,分析 Th17細(xì)胞和IL-17A表達(dá)與 MCMV載量及脾和

2、唾液腺病理改變的相關(guān)性,探討 Th17細(xì)胞在急性播散性 MCMV感染致病機(jī)制中的作用。
　　方法：
　　1)建立動(dòng)物模型:45只4.5周齡BALB/c小鼠,腹腔接種(5×103)PFU MCMV Smith株,建立播散性感染模型,另45只小鼠模擬感染做為對(duì)照。于病毒接種后3 d、7 d、14 d、28 d(急性期末)和45 d,收集小鼠靜脈血和無(wú)菌分離脾、唾液腺、肝和肺組織。為獲取足夠的脾巨噬細(xì)胞和血清樣本量,各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)

3、隨機(jī)抽取3只小鼠為1小組,其靜脈血予以混合,脾臟各取2/3加以混合富集巨噬細(xì)胞,其余組織樣本隨機(jī)抽取3份,故每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本數(shù)為3;
　　2) AIM2炎性體通路蛋白表達(dá):分離小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞,提取蛋白,用Western blot法檢測(cè)AIM2炎性體通路蛋白包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1的表達(dá)強(qiáng)度,設(shè)GAPDH為內(nèi)參蛋白,以各目的蛋白與GAPDH蛋白積分光密度比值(K值)進(jìn)行半定量分析;

4、r>　　3)血清IL-1β和IL-18水平:用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中AIM2炎性體通路下游細(xì)胞因子IL-1β和IL-18水平的變化;
　　4)優(yōu)化Th17細(xì)胞分化誘導(dǎo)方案:分離3只正常小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞;分別應(yīng)用無(wú)刺激、滅活MCMV、PMA/Ionomycin、滅活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法;在脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)刺激不同時(shí)間后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4 IL-17A+細(xì)胞比+率;并用雙抗體夾心EL

5、ISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17A蛋白濃度,觀察分析不同方法誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的效應(yīng),選擇最佳的分化誘導(dǎo)方法;
　　5)脾Th17細(xì)胞比率和病毒特異性IL-17A表達(dá)水平:取急性期階段即感染后3 d、7 d、14 d和28 d的脾組織,分離脾臟淋巴細(xì)胞。采用滅活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+IL-17A+細(xì)胞比率。用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上

6、清中IL-17A濃度時(shí),設(shè)立單獨(dú)PMA/Ionomycin刺激組作為基礎(chǔ)刺激對(duì)照,計(jì)算滅活MCMV/PMA/Ionomycin刺激和單獨(dú)PMA/Ionomycin刺激脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A濃度之差值來(lái)評(píng)估病毒特異性IL-17A表達(dá)水平。對(duì)比分析兩組之間的差異;
　　6)不同臟器組織中IL-17A蛋白表達(dá):用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)急性期試驗(yàn)小鼠脾、唾液腺、肝、肺組織中IL-17A蛋白的表達(dá)分布情況,對(duì)比分析不同臟器組織的局

7、部免疫特征;
　　7)脾和唾液腺病理變化:取脾和唾液腺組織切片行HE染色,半定量評(píng)估急性期試驗(yàn)小鼠脾和唾液腺組織的病理變化;
　　8) MCMV病毒載量:用標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗(yàn)檢測(cè)急性期各臟器組織內(nèi)感染性病毒滴度;
　　9)相關(guān)性分析:對(duì)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A和組織中IL-17A蛋白表達(dá)水平與脾和唾液腺組織病理?yè)p傷程度及病毒載量進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1) AIM2炎性體通路蛋白表達(dá):MC

8、MV感染后的脾巨噬細(xì)胞提取蛋白中,AIM2炎性體通路各組分包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)一致性變化,均在感染后3 d(感染早期)顯著升高達(dá)峰值,與模擬感染對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, K值分別為(1.120±0.243) vs(0.230±0.046);(1.318±0.333) vs(0.248±0.090);(2.049±0.401) vs(0.390±0.120);(1.483±0

9、.420) vs(0.176±0.045),均P<0.01;其后表達(dá)均下降,與對(duì)照組水平相當(dāng);
　　2)血清IL-1β和IL-18水平:MCMV感染組血清IL-1β和IL-18濃度于感染后3 d明顯高于模擬感染對(duì)照組,IL-1β濃度為(111.050±28.500)vs(55.858±2.983)pg/ml, P<0.05;IL-18濃度達(dá)(99.911±2.222)vs(57.206±6.228)pg/ml,P<0.01;

10、>　　3)優(yōu)化Th17細(xì)胞分化誘導(dǎo)方法:無(wú)刺激組和滅活MCMV刺激組均不能有效誘導(dǎo)Th17細(xì)胞表達(dá)。與應(yīng)用相同方法培養(yǎng)刺激1 d+6 h組及應(yīng)用PMA/Ionomycin培養(yǎng)刺激6 h組相比,滅活MCMV+PMA/Ionomycin培養(yǎng)刺激6 h組能夠有效誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化[Th17細(xì)胞比率分別為(0.163±0.035) vs(0.0830.032)％,P<0.05;±(0.1630.035) vs(0.0330.015)％,P<0

11、.01];同時(shí),脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A濃度也明顯升高[分別為(67.246±±4.578) vs(45.317±±8.793) pg/ml,P<0.05;(67.2464.578) vs(24.4745.134) pg/ml,P<0.01];±±
　　4)脾Th17細(xì)胞比率和病毒特異性IL-17A表達(dá)水平:MCMV感染后3 d,7 d,14 d,28 d,小鼠脾淋巴細(xì)胞體外經(jīng)優(yōu)化方法誘導(dǎo)分化,Th17細(xì)胞比率均高于模擬感

12、染對(duì)照組[分別為(0.67±0.13) vs(0.22±0.02)％,P=0.004;(0.82±0.02) vs(0.18±0.06)％,P=0.004;(1.14±0.09) vs(0.19±0.04)％,P=0.000;(0.47±0.11)vs(0.20±0.06)％,P=0.017]。MCMV感染組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A蛋白濃度在感染后3、7 d雖有升高,但與模擬感染對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);

13、而感染后14 d達(dá)峰值,明顯高于對(duì)照組[(81.98±12.37) vs(44.96±8.44) pg/ml,P<0.01];至感染后28 d雖有下降,但仍高于對(duì)照組[(57.58±8.14) vs(35.10±10.41) pg/ml,P<0.05];
　　5)不同臟器組織中IL-17A蛋白表達(dá):MCMV感染鼠的肝、肺組織中僅于感染后3d可見(jiàn)少量 IL-17A+細(xì)胞;脾和唾液腺組織中可見(jiàn)明顯增多的IL-17A+細(xì)胞,并于感染后1

14、4 d達(dá)峰值,且部分唾液腺分泌管上皮細(xì)胞也表達(dá) IL-17A;
　　6)脾和唾液腺病理變化:MCMV感染后14 d脾組織病理?yè)p傷程度最重:白髓結(jié)構(gòu)明顯破壞,可見(jiàn)大量吞噬細(xì)胞、出血壞死及纖維條索增生;MCMV感染后14 d唾液腺組織病理?yè)p傷程度也最嚴(yán)重:出現(xiàn)大量炎性浸潤(rùn)灶,組織結(jié)構(gòu)明顯破壞;
　　7) MCMV病毒滴度:肝和脾組織病毒滴度于感染后3 d升高,其后迅速下降,14 d檢測(cè)不到;肺組織病毒滴度低于檢測(cè)低限,而唾液腺組

15、織病毒滴度呈逐漸增高趨勢(shì),于感染后14 d達(dá)峰值;
　　8)相關(guān)性分析:脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性 IL-17A蛋白濃度與唾液腺組織病毒滴度呈正相關(guān)(r=0.74,P<0.01);脾和唾液腺組織病理?yè)p傷越重,脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性 IL-17A蛋白濃度越高(r=0.78, P<0.01);唾液腺組織內(nèi)的IL-17A蛋白表達(dá)與 MCMV滴度變化呈正相關(guān)(r=0.63,P<0.05),并與脾和唾液腺組織病理?yè)p傷程度也呈正相關(guān)(

16、r=0.68,P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1)在 MCMV感染早期,小鼠脾巨噬細(xì)胞 AIM2感受器能夠識(shí)別胞內(nèi) MCMV DNA;AIM2炎性體參與 MCMV感染早期的抗病毒天然免疫應(yīng)答;同時(shí),通過(guò)其下游細(xì)胞因子 IL-1β和IL-18在啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　2) MCMV感染急性期 IL-17A蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯組織差異性分布,其在唾液腺中高表達(dá)的局部免疫特征可能是 MCMV能夠在唾液腺中長(zhǎng)