Wnt-Ca2+信號(hào)途徑在黑素瘤發(fā)展過(guò)程中作用的初步研究.pdf

1、皮膚黑素瘤是一種高惡性、發(fā)展快、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的惡性腫瘤，然而，目前還缺少能確定黑素瘤是否具有高侵襲性的特異性標(biāo)志。Wnt信號(hào)通路是近年來(lái)備受關(guān)注的一條調(diào)控胚胎發(fā)育和腫瘤形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前認(rèn)為，Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑和非經(jīng)的Wnt/Ca2+途徑及Wnt/JNK途徑，已有的文獻(xiàn)資料及我們的前期研究結(jié)果顯示，經(jīng)典Wnt/β-catenin通路在惡性黑素瘤中被激活，可能在黑素瘤的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。但是

2、目前對(duì)于非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路在黑素瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的激活狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化及其功能意義并不明確。因此，本課題以來(lái)自不同生長(zhǎng)階段的六種黑素瘤細(xì)胞系為標(biāo)本，采用RT-PCR法檢測(cè)Wnt/Ca2+信號(hào)途徑激活的關(guān)鍵配體Wnt5a和Wnt11的基因表達(dá)水平；運(yùn)用鈣離子成像的方法，結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)卡巴膽堿對(duì)上述細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響及蛋白激酶C的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步揭示該信號(hào)途徑在黑素瘤發(fā)展過(guò)程中的功能意義。
　　第一部分，正常黑素細(xì)胞和

3、六種黑素瘤細(xì)胞的形態(tài)特征及侵襲能力比較
　　細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示：培養(yǎng)的正常黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)方式和細(xì)胞形態(tài)上均有顯著的不同。培養(yǎng)的表皮黑素細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則的渦旋狀生長(zhǎng)方式，細(xì)胞形態(tài)為纖細(xì)的雙極紡錘狀，細(xì)胞核清晰，黑素顆粒少見(jiàn)。淺表擴(kuò)散型惡性黑素瘤（primary superficial spreading situation）（WM793B細(xì)胞株）形態(tài)多為雙極紡錘狀，黑素顆粒較多；結(jié)節(jié)性惡性黑素瘤（nodular melanoma

4、 situation）（451Lu細(xì)胞株）形態(tài)為樹枝狀；來(lái)自黑素瘤腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的SK-MEL-5細(xì)胞株形態(tài)為短紡錘狀，并有局部聚集生長(zhǎng)的傾向；來(lái)自黑素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（lymph node metastases）、具有高侵襲特性的A2058細(xì)胞呈局部聚集生長(zhǎng)，形態(tài)主要為紡錘狀；Libr細(xì)胞和A-375細(xì)胞也呈現(xiàn)紡錘狀。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示：來(lái)自黑素瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段的A2058細(xì)胞和SK-MEL-5細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，可以在12小時(shí)和24小

5、時(shí)侵入劃痕區(qū)域；結(jié)節(jié)性惡性黑素瘤451Lu細(xì)胞在48小時(shí)開始侵入劃痕區(qū)域，而淺表擴(kuò)散型惡性黑素瘤WM793B細(xì)胞在48小時(shí)內(nèi)未見(jiàn)明顯的變化。結(jié)果提示：與正常的黑素細(xì)胞相比，六種黑素瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)出典型的腫瘤細(xì)胞特性，即細(xì)胞膜、細(xì)胞核的形態(tài)異質(zhì)性以及生長(zhǎng)方式的不規(guī)則性，并且隨著黑素瘤由淺表擴(kuò)散至淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不同發(fā)展階段，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力逐漸增強(qiáng)。
　　第二部分，不同生長(zhǎng)階段黑素瘤中Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化及其意義

6、r>　　運(yùn)用RT-PCR法，檢測(cè)正常黑素細(xì)胞和六種來(lái)自不同生長(zhǎng)階段的皮膚黑素瘤細(xì)胞（包括WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375）中Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)水平。結(jié)果表明：在正常黑素細(xì)胞和不同的黑素瘤細(xì)胞中，Wnt5A和Wnt11基因的表達(dá)均表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的特征，并且二者的變化是一致的。Wnt5A和Wnt11水平在正常黑素細(xì)胞中表達(dá)很低，而在黑素瘤有不同程度的升高。另外，分別來(lái)自于淺表擴(kuò)散型惡性

7、黑素瘤、結(jié)節(jié)性惡性黑素瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段的WM793B、451Lu和A2058細(xì)胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)水平逐漸下降，甚至在A2058細(xì)胞系中，兩種基因的表達(dá)均低于正常黑素細(xì)胞。結(jié)果提示：在黑素瘤的不同發(fā)展階段，Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化使非經(jīng)典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同，從而影響腫瘤的侵襲能力。
　　第三部分，卡巴膽堿對(duì)不同生長(zhǎng)階段的黑素瘤細(xì)胞中鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響及蛋白激酶C的調(diào)節(jié)作用
　

8、　鈣離子成像的結(jié)果顯示：正常黑素細(xì)胞對(duì)卡巴膽堿（1mM）無(wú)明顯反應(yīng)，而WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375細(xì)胞對(duì)卡巴膽堿（1mM）誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化反應(yīng)均有不同程度的升高，其中以來(lái)自淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的A2058細(xì)胞最為顯著。提前給予蛋白激酶C的激動(dòng)劑phorbol12,13-dibutyrate(PDBu,2μM)對(duì)上述卡巴膽堿誘發(fā)的胞內(nèi)鈣離子濃度變化具有不同的抑制作用。結(jié)果提示：在黑素瘤發(fā)展過(guò)

9、程中，介導(dǎo)卡巴膽堿誘發(fā)鈣離子穩(wěn)態(tài)變化的毒蕈堿樣膽堿能受體在表型或功能上是動(dòng)態(tài)變化的，蛋白激酶C參與該受體功能的調(diào)節(jié)。在來(lái)自淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段的A2058細(xì)胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)很低，卡巴膽堿誘發(fā)的細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)的反應(yīng)卻顯著高于其他檢測(cè)細(xì)胞，該結(jié)果提示：Wnt/Ca2+信號(hào)通路的下游信號(hào)分子——細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C的激活可以抑制卡巴膽堿誘發(fā)的鈣離子穩(wěn)態(tài)的變化，進(jìn)一步證實(shí)了蛋白激酶C的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)論：1.實(shí)驗(yàn)所用WM

10、793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375黑素瘤細(xì)胞分別來(lái)自腫瘤的不同發(fā)展階段。形態(tài)學(xué)試驗(yàn)和侵襲能力檢測(cè)結(jié)果提示：六種黑素瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)出典型的腫瘤細(xì)胞特性，即細(xì)胞膜、細(xì)胞核的形態(tài)異質(zhì)性以及生長(zhǎng)方式的不規(guī)則性，并且隨著黑素瘤由淺表擴(kuò)散至淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不同發(fā)展階段，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力逐漸增強(qiáng)。運(yùn)用這些腫瘤細(xì)胞株可以模擬黑素瘤動(dòng)態(tài)發(fā)展的過(guò)程。2.在黑素瘤的不同發(fā)展過(guò)程中，Wnt5A和Wnt11基因的表達(dá)均表現(xiàn)出動(dòng)態(tài)

11、變化的特征，并且二者的變化是一致的。分別來(lái)自于淺表擴(kuò)散型惡性黑素瘤、結(jié)節(jié)性惡性黑素瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段的WM793B、451Lu和A2058細(xì)胞系中，Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)水平有逐漸下降的趨勢(shì)，甚至在A2058細(xì)胞系中，兩種基因的表達(dá)均低于正常黑素細(xì)胞。結(jié)果提示：在黑素瘤的不同發(fā)展階段，Wnt5A和Wnt11基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化使非經(jīng)典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同，從而影響腫瘤的侵襲能力。3.與正常黑素細(xì)胞相比，卡巴膽堿對(duì)不同