Wnt4信號(hào)在胸腺增齡性萎縮過(guò)程中的作用研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)探討隨年齡增長(zhǎng)小鼠胸腺內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，以及在此過(guò)程中Wnt4信號(hào)的變化，并研究增強(qiáng)Wnt4信號(hào)對(duì)體外培養(yǎng)的胸腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)而了解Wnt4信號(hào)在胸腺增齡性萎縮過(guò)程中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)胸腺與老化，提高老齡人口健康水平提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　方法
　　1、小鼠自然老化模型
　　購(gòu)買(mǎi)時(shí)1月齡C57BL/6小鼠，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)飼養(yǎng)到不同月齡，每組6～8只，雌雄各半。

2、所有小鼠均在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心動(dòng)物部SPF級(jí)室飼養(yǎng)。
　　2、分離純化胸腺細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞
　　(1)將胸腺組織在無(wú)菌PBS中漂洗幾遍，然后用含膠原酶Ⅱ，胰酶和DNaseⅠ酶的消化液37℃消化30min。
　　(2)細(xì)胞懸液首先與偶聯(lián)有小鼠CD45抗體的磁珠(Miltenyi)進(jìn)行孵育，然后經(jīng)有磁性的LS柱吸附，最后用MACSbuffer洗脫。CD45為淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)，因此陰性分選到的是胸腺基質(zhì)細(xì)胞

3、，而陽(yáng)性吸附的則為胸腺細(xì)胞。
　　3、檢測(cè)不同年齡階段TECs和各胸腺細(xì)胞亞群的增殖和凋亡水平
　　(1)增殖水平的測(cè)定:C57BL/6小鼠腹腔注射Edu。24h后收集胸腺組織并制備單細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行磁珠分選。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，胸腺細(xì)胞進(jìn)行CD4和CD8抗體標(biāo)記，胸腺基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行EpCAM1抗體標(biāo)記。然后按照Edu檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。
　　(2)凋亡分析:首先使用磁珠分選法分離純化TSCs和胸腺細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面

4、抗體標(biāo)記后按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC熒光標(biāo)記，同時(shí)PI標(biāo)記用于去除死細(xì)胞。
　　4、檢測(cè)不同年齡TSCs和胸腺細(xì)胞Wnt4信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)水平
　　分離不同年齡階段TSCs和胸腺細(xì)胞后用TRIzol試劑提取出總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitate realtime-PCR)，檢測(cè)隨年齡增長(zhǎng)，TSCs和胸腺細(xì)胞中Wnt4、FoxN1、Bcl-xL基因

5、表達(dá)水平的變化。
　　5、檢測(cè)外源Wnt4信號(hào)對(duì)MTEC1細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　(1)凋亡影響:對(duì)照組（僅細(xì)胞培養(yǎng)液）;Dex實(shí)驗(yàn)組;Dex+Wnt4實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)48h后，AnnexinⅤ法檢測(cè)各組MTEC1細(xì)胞凋亡水平。
　　(2)增殖影響:MTEC1細(xì)胞分別用LiCl刺激(24h)或外源重組Wnt4蛋白刺激(16h)，Edu法測(cè)細(xì)胞增殖變化。
　　結(jié)果:
　　1、隨年齡增長(zhǎng)，胸腺老化的表現(xiàn)以及Wnt

6、4信號(hào)的變化
　　隨年齡增長(zhǎng)，胸腺體積逐漸縮小;胸腺內(nèi)各種細(xì)胞數(shù)量（包括胸腺總細(xì)胞數(shù)，TECs數(shù)，胸腺細(xì)胞總數(shù)以及CD4、CD8、DN、DP亞群細(xì)胞數(shù)）也隨年齡增長(zhǎng)而明顯減少。同時(shí)隨年齡增長(zhǎng)，TSCs和胸腺細(xì)胞中Wnt4信號(hào)相關(guān)基因Wnt4、FoxN1和Bcl-xL表達(dá)量都有所下降。并且在胸腺中Wnt4蛋白主要是由TSCs所分泌的。
　　2、隨年齡增長(zhǎng)，TECs和各胸腺細(xì)胞亞群增殖及凋亡水平的變化
　　Edu檢測(cè)結(jié)果表

7、明隨年齡增長(zhǎng)，TECs和各胸腺細(xì)胞亞群的增殖水平持續(xù)下降。另外，細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明老年小鼠胸腺內(nèi)各種細(xì)胞(包括TECs、CD4、CD8、DP、DN、ETP)的凋亡比例都明顯增高。
　　3、外源性Wnt4信號(hào)對(duì)MTEC1細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　(1)相比較對(duì)照組，Dex作用下MTEC1細(xì)胞凋亡比例增加，而在同時(shí)添加Dex和外源Wnt4蛋白的培養(yǎng)液中，MTEC1細(xì)胞凋亡比例可維持在正常水平，說(shuō)明外源性Wnt4信號(hào)能有效的減輕

8、Dex對(duì)MTEC1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　(2)通過(guò)體外添加LiCl和外源Wnt4蛋白的方法激活Wnt4信號(hào)，流式分析結(jié)果顯示MTEC1細(xì)胞增殖比例增加約10％。可見(jiàn)，激活Wnt4信號(hào)能夠有效的促進(jìn)MTEC1細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論:
　　在胸腺增齡性萎縮過(guò)程中，Wnt4信號(hào)的改變是引起細(xì)胞增殖和凋亡失衡的一個(gè)原因。Wnt4信號(hào)能有效的促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，而隨年齡增長(zhǎng)，胸腙內(nèi)細(xì)胞分泌Wnt4蛋白能力下降，影響下