Wnt信號分子在脂肪代謝中的作用及其蛋白性質(zhì)研究.pdf

1、Wnt蛋白與位于細胞膜上的受體Frizzled(Fzd)相結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達，在胚胎的發(fā)育過程中有重要的作用。最近研究又表明Wnt家族分子與脂肪代謝有密切關(guān)系，本試驗應(yīng)用RNAi的方法研究Wnt家族中的Wnt5b和受體Fzd4在脂肪代謝中的作用。 3T3-L1細胞是研究脂肪細胞分化的細胞模型。用RT-PCR的方法檢測Wnt家族分子在3T3-L1脂肪生成過程中表達水平的變化，其中Wnt5b在脂肪細胞分化后期

2、表達水平明顯升高，受體分子Fzd4在脂肪生成過程中表達量比較高。因此，應(yīng)用RNAi技術(shù)特異的抑制Wnt5b基因和Fzd4基因在3T3-L1細胞中的表達。由于3T3-L1細胞的轉(zhuǎn)染效率非常低，所以，將RNAi載體與相應(yīng)基因共轉(zhuǎn)染效率很高的293T細胞，選出有效的RNAi靶序列，再將其轉(zhuǎn)染3T3-L1細胞觀察在脂肪分化過程中的作用。 設(shè)計Wnt5b和Fzd4基因各兩條持異性序列的62bp寡核苷酸片段，將此片段構(gòu)建到含有Hl啟動子并具

3、有綠色熒光蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQsupR/F中，將構(gòu)建的RNAi載體與相應(yīng)基因共轉(zhuǎn)染293T細胞，以免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染后相應(yīng)基因在細胞中的表達水平。結(jié)果兩種Fzd4不同特異性序列的RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后均能干擾該基因在細胞中的表達。一種Wnt5b特異性序列的RNAi質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能干擾該基因在細胞中的表達。將選出的RNAi的載體轉(zhuǎn)染Phenoix細胞包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。收集含逆轉(zhuǎn)錄病毒的Phenoix細胞的上清感染3T3-L1細胞，油紅O染色，用