Wnt5a-JNK信號(hào)及γ-catenin在CML中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　Wnt信號(hào)與腫瘤的關(guān)系一直是國(guó)際研究熱點(diǎn)。我們前期研究表明Wnt5a在白血病中是一種腫瘤抑制因子;并且Wnt5a與Ror2受體結(jié)合,激活非經(jīng)典Wnt信號(hào),并抑制經(jīng)典信號(hào)及β-catenin的促癌功能。但Wnt5a是通過(guò)什么關(guān)鍵分子拮抗經(jīng)典Wnt信號(hào)?它們是否也影響了CML的特效藥物Imatinib Mesylate(甲磺酸伊馬替尼)對(duì)CML的抑制作用?目前國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道,值得深入研究。
　　已有報(bào)道,在某些細(xì)胞

2、中Wnt5a可與細(xì)胞膜上Ror2、Fz受體分子結(jié)合,并激活JNK,即激活Wnt5a/JNK非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。在CML細(xì)胞中,對(duì)JNK的研究目前很有限,并有不同的結(jié)論:早期的研究認(rèn)為BCR-ABL激活JNK,并且后者參與了BCR-ABL介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化;另一方面,JNK參與了一些化合物誘導(dǎo)BCR-ABL陽(yáng)性CML細(xì)胞凋亡的過(guò)程。在CML細(xì)胞中,Wnt5a是否可激活JNK,JNK是否參與了Wnt5a對(duì)Imatinib Mesylate抗白血病

3、的促進(jìn)作用?其機(jī)制又是什么?這些問(wèn)題需要我們的進(jìn)一步證明。
　　γ-catenin是Armadillo蛋白家族(包括α-catenin、β-catenin和γ-catenin)的一個(gè)成員,在細(xì)胞中它主要參與粘附作用與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。γ-catenin作為Wnt信號(hào)通路的一員,它與Wnt5a的關(guān)系如何?它是否也參與了Wnt5a對(duì)ImatinibMesylate抗白血病的作用?這些目前國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道,值得深入研究。在血液腫瘤中,以前的研究

4、表明,AML(AcuteMyeloidLeukemia,急性髓系白血病)融合基因AML1-ETO,PML-RARα和PLZF-RARα所表達(dá)的蛋白均可促進(jìn)γ-catenin的表達(dá),但是CML細(xì)胞中的融合基因BCR-ABL所表達(dá)的蛋白是否調(diào)節(jié)γ-catenin的表達(dá)還未見報(bào)道。Kim等的研究發(fā)現(xiàn):相對(duì)于CML慢性期的病人,加速期與急變期的病例中γ-catenin高表達(dá),提示γ-catenin在CML中可能發(fā)揮重要作用,但確切的作用及其機(jī)制

5、尚需深入研究。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,以解決以下幾個(gè)問(wèn)題為目的:1.Wnt5a是否可通過(guò)激活JNK影響Imatinib Mesylate的抗白血病作用?2.γ-catenin是否可以被Wnt5a調(diào)節(jié)?3.γ-catenin是否可以被BCR-ABL調(diào)節(jié),并且在CML中發(fā)揮什么作用?并且γ-catenin是否也能夠影響ImatinibMesylate的抗白血病作用?研究結(jié)果有助于深入認(rèn)識(shí)Wnt5a/JNK與γ-catenin在

6、白血病中的作用及機(jī)制,為臨床治療CML提供新的策略。
　　方法:
　　1.Wnt5a通過(guò)JNK影響Imatinib Mesylate抑制CML細(xì)胞作用及其機(jī)制研究。
　　1.1.構(gòu)建過(guò)表達(dá)Wnt5a的細(xì)胞株(KU812-Wnt5a);Wnt5a在CML細(xì)胞中對(duì)β-catenin及其下游基因Survivin表達(dá)的影響,以及對(duì)γ-catenin表達(dá)水平的影響;檢測(cè)過(guò)表達(dá)Wnt5a對(duì)ImatinibMesylate抑制CML

7、細(xì)胞株(K562,KU812)的影響(抑制CML細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)CML細(xì)胞凋亡,抑制BCR-ABL表達(dá)及活性)。
　　1.2.檢測(cè)過(guò)表達(dá)Wnt5a對(duì)JNK表達(dá)及其活性(磷酸化水平)的影響;JNK受到抑制后Wnt5a對(duì)β-catenin/Survivin表達(dá)的影響;使用JNK抑制劑SP600125抑制JNK活性,然后檢測(cè)ImatinibMesylate抑制細(xì)胞株K562-Wnt5a、KU812-Wnt5a的變化。
　　1.3.構(gòu)

8、建過(guò)表達(dá)JNK1與JNK2的CML細(xì)胞株,檢測(cè)JNK對(duì)ImatinibMesylate抑制CML細(xì)胞株的影響,以及對(duì)β-catenin及其下游基因Survivin表達(dá)的影響,以及對(duì)γ-catenin表達(dá)水平的影響。
　　1.4.構(gòu)建K562細(xì)胞NOD/SCID鼠移植瘤模型;檢測(cè)Wnt5a在體內(nèi)對(duì)ImatinibMesylate抑制成瘤生長(zhǎng)的影響以及對(duì)BCR-ABL表達(dá)的影響。
　　2.γ-catenin在CML中作用的研究<

9、br>　　2.1.檢測(cè)不同白血病細(xì)胞株中γ-catenin的表達(dá)情況;構(gòu)建BCR-ABLsiRNA的CML細(xì)胞株,檢測(cè)BCR-ABL對(duì)γ-catenin表達(dá)的影響;用免疫共沉淀的方法檢測(cè)蛋白BCR-ABL與γ-catenin的相互作用。
　　2.2.構(gòu)建γ-cateninsiRNA的CML細(xì)胞株;檢測(cè)γ-catenin受到抑制后CML細(xì)胞增殖及克隆形成的變化,以及細(xì)胞增殖有關(guān)的基因cycliD1及c-Myc表達(dá)的變化。
　　

10、2.3.檢測(cè)抑制γ-catenin對(duì)ImatinibMesylate抑制CML細(xì)胞株(抑制增殖,誘導(dǎo)凋亡)的影響,以及基因Survivin、Bcl-xL表達(dá)的變化。
　　2.4.檢測(cè)γ-catenin受到抑制后核轉(zhuǎn)錄因子STAT5磷酸化水平的變化,β-catenin表達(dá)水平及磷酸化水平以及核轉(zhuǎn)位情況,以及Wnt信號(hào)中調(diào)節(jié)β-catenin的關(guān)鍵分子GSK3β及其磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.Wnt5a/JNK

11、信號(hào)通路促進(jìn)了ImatinibMesylate對(duì)CML細(xì)胞的抑制作用;并且Wnt5a可以抑制γ-catenin的表達(dá),但并不是通過(guò)JNK。
　　1.1.在過(guò)表達(dá)Wnt5a的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn):Wnt5a抑制了β-catenin及其下游基因Survivin,也抑制了γ-catenin的表達(dá);Wnt5a可促進(jìn)ImatinibMesylate對(duì)CML細(xì)胞株增殖的抑制,增強(qiáng)其誘導(dǎo)凋亡的能力,并促進(jìn)ImatinibMesylate抑制BCR-AB

12、L融合基因表達(dá)及抑制其活性的能力。
　　1.2.Wnt5a對(duì)JNK表達(dá)水平無(wú)影響,但能活化JNK(磷酸化水平升高);用JNK抑制劑SP600125抑制JNK活性后,削弱了Wnt5a對(duì)ImatinibMesylate抗白血病的增強(qiáng)作用,也削弱了Wnt5a對(duì)β-catenin及其下游基因Survivin的抑制。
　　1.3.在過(guò)表達(dá)JNK1與JNK2的CML細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn):JNK促進(jìn)了對(duì)ImatinibMesylate抑制CML細(xì)

13、胞株的作用;JNK1/JNK2均抑制了β-catenin及其下游基因Survivin,但對(duì)γ-catenin沒(méi)有影響。
　　1.4.成功構(gòu)建K562細(xì)胞NOD/SCID鼠移植瘤模型;Wnt5a在體內(nèi)增強(qiáng)了ImatinibMesylate對(duì)移植瘤生長(zhǎng)和BCR-ABL表達(dá)的抑制。
　　2.γ-catenin在CML中作用的研究
　　2.1.在7個(gè)白血病細(xì)胞株中,γ-catenin只在K562、KU812兩個(gè)CML細(xì)胞中表達(dá)

14、;構(gòu)建成功BCR-ABLsiRNA的CML細(xì)胞株,并且發(fā)現(xiàn)BCR-ABL表達(dá)下降后γ-catenin表達(dá)也下降;免疫共沉淀結(jié)果顯示BCR-ABL蛋白與γ-catenin并未像BCR-ABL與β-catenin一樣相互結(jié)合。
　　2.2.構(gòu)建成功γ-cateninsiRNA的CML細(xì)胞株;并且發(fā)現(xiàn)抑制γ-catenin時(shí),CML細(xì)胞增殖減慢,克隆形成能力也降低,與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因cyclinD1及c-Myc表達(dá)均下降。
　　

15、2.3.抑制γ-catenin后,ImatinibMesylate對(duì)CML細(xì)胞株的抑制作用(抑制增殖,誘導(dǎo)凋亡)增強(qiáng);凋亡相關(guān)基因Survivin、Bcl-xL表達(dá)下降。
　　2.4.抑制γ-catenin后核轉(zhuǎn)錄因子STAT5磷酸化水平下降;GSK3β表達(dá)水平上升,而磷酸化水平下降;總β-catenin表達(dá)水平無(wú)明顯變化,但其磷酸化水平升高,且核內(nèi)β-catenin蛋白水平下降。
　　結(jié)論:
　　1.在CML中,Wn

16、t5a可活化JNK,并通過(guò)JNK促進(jìn)藥物ImatinibMesylate的作用,其機(jī)制與其抑制β-catenin及其下游基因Survivin表達(dá)有關(guān)。Wnt5a還能抑制Wnt相關(guān)分子γ-catenin,但與JNK無(wú)關(guān),該作用也是Wnt5a增強(qiáng)ImatinibMesylate抑制CML的作用機(jī)制之一。
　　2.在CML中,γ-catenin高表達(dá),這與BCR-ABL上調(diào)γ-catenin有關(guān),這種調(diào)節(jié)不是二者直接結(jié)合的方式。下調(diào)γ-