StarD7及Wnt-β-Catenin信號通路在annexin5刺激Leydig Cell睪酮合成過程中的機制研究.pdf

1、膜聯(lián)蛋白5（annexin 5）是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，其分子量約為36kD，annexin 5因為其基因5'區(qū)域不含有TATA閱讀框，而被認為是一管家基因。其具有多種生物學功能，如抗凝血、抑制蛋白酶C的活性等。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，annexin 5對睪酮合成的調(diào)控作用呈明顯的時間和劑量依賴性。
　　StarD7是類固醇敏感性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)相關脂類轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員之一，該蛋白在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞代謝、相關信號轉(zhuǎn)

2、導等方面發(fā)揮著重要的生物學功能。其全長序列中含有一個類固醇敏感性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)相關脂類轉(zhuǎn)運體結(jié)構(gòu)域（START），該結(jié)構(gòu)域由210個氨基酸殘基組成，可特異性的結(jié)合脂類，如磷脂類、甾醇類、鞘脂類等。其主要參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的過程，它能與膜上的靶蛋白結(jié)合，并發(fā)揮著催化劑的作用。
　　本課題組先前的研究利用二維凝膠電泳技術建立了annexin 5刺激大鼠睪丸Leydig細胞睪酮分泌的差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)在annexin 5刺激的Leydig

3、細胞中上調(diào)蛋白有23個，下調(diào)蛋白有13個，其中StarD7是典型的上調(diào)蛋白。相關文獻報道Wnt/β-catenin信號通路參與StarD7蛋白的起始調(diào)控。
　　StarD7和Wnt/β-catenin信號通路是否參與調(diào)節(jié)annexin 5刺激大鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成，為回答這個問題，本實驗從以下三部分展開:
　　第一部分，觀察StarD7、β-catenin參與調(diào)控annexin 5刺激大鼠睪丸間質(zhì)細胞睪酮合成的過程，結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn)，在annexin5刺激作用下，伴隨著睪酮合成的增加，StarD7、β-catenin在蛋白表達水平均有所增加，并且免疫熒光的結(jié)果顯示，β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)有聚集并進入核內(nèi)的趨勢。
　　第二部分，利用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Dkk1與A5共同作用于原代睪丸Leydig細胞，觀察Wnt/β-catenin信號通路被抑制后，大鼠睪丸Leydig細胞睪酮合成是否有變化。初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Dkk1的單獨作用下，睪酮、

5、StarD7、β-catenin、3β-HSD、17β-HSD的表達均有所下降，且在Dkk1和A5共同作用下，與單獨A5作用相比，睪酮、StarD7、β-catenin、3β-HSD的表達均有不同程度的下降。由此提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路參與Leydig細胞睪酮合成，并可能是通過StarD7、3β-HSD來具體調(diào)控睪酮合成的過程。
　　第三部分，利用siRNA干擾技術干擾StarD7蛋白的表達，觀察StarD7被干擾后

6、大鼠睪丸Leydig細胞睪酮合成是否有影響。為提高siRNA干擾效率，我們進行了一系列的條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在細胞密度為80％、siRNA-StarD7干擾濃度為100 nmol/L、siRNA-StarD7與GenEscortTMⅡ轉(zhuǎn)染試劑的比例為1∶2的條件下，干擾效果較好。在此基礎上，在StarD7的表達被干擾后，睪酮合成明顯下降，其關鍵合成調(diào)節(jié)酶3β-HSD、17β-HSD在mRNA水平和蛋白水平均有顯著性下降。由此說明，睪酮的合成可