Wnt-β-catenin信號通路在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)心血管并發(fā)癥的重要組成部分，也是DM患者死亡的主要原因。本課題旨在研究DCM發(fā)生發(fā)展過程中大鼠心肌Wnt/β-catenin信號通路的變化規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制，完善DCM的病理生理機(jī)制，為DCM的治療尋找新的治療靶點(diǎn)和新藥開發(fā)目標(biāo)。
　　方法：1. 模型建立、實驗分組及樣本收集
　　1型糖尿病大鼠模型的建

2、立采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)60 mg/kg，以72h后空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)≥16.7mmol/L，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和體重下降者為DM模型成功。按體重均衡的原則隨機(jī)將非糖尿病組(non-diabetic，ND)大鼠和造模成功的DM組大鼠各分為2，4，8和12周四組，每組≥10只。分別在2，4，8和12周時測FBG，稱體重(body weight，

3、BW)，麻醉后腹主動脈取血，迅速取出心臟并剔除血管、脂肪等非心肌組織，稱心臟及左心室重量(heartweight，HW;left ventricular weight，LVW)，并計算心臟指數(shù)（cardiac index，CI，HW/BW）及左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular weight index，LVWI，LVW/BW)。分離的左心室一部分于10％甲醛溶液中固定，另一部分于液氮中保存待用。
　　2. 2周糖尿病

4、大鼠病理觀察及指標(biāo)檢測
　　HE染色法觀察2周大鼠心肌組織病理改變;免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical，IHC)和Western blotting(WB)檢測2周大鼠心肌Wnt2，β-catenin，c-Myc和DKK1的蛋白表達(dá)變化。
　　3. 4，8，12周糖尿病大鼠病理觀察及指標(biāo)檢測
　　ELISA法檢測空腹血漿胰島素水平;HE及Masson三色染色法觀察大鼠心肌組織病理改變;TUNEL法檢測

5、大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平的變化;WB及IHC法檢測心肌組織中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化;qRT-PCR檢測心肌組織中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1. 糖尿病大鼠一般狀況及病理組織學(xué)改變
　　與ND組比較，DM組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛無光澤，腥臊酮臭味加重、稀便等。DM組大鼠FBG明顯升高，F(xiàn)INS水平、HW及LVW均明顯降低，CI

6、及LVWI均高于ND組。HE結(jié)果顯示2周DM組大鼠心肌出現(xiàn)局灶性心肌細(xì)胞變性、壞死，但未觀察到明顯的心肌肥大。4，8，12周時DM組大鼠心肌膠原沉積面積持續(xù)性升高，心肌細(xì)胞橫截面面積明顯高于ND組，表明心肌纖維化及心肌肥大的出現(xiàn);TUNEL結(jié)果顯示，4，8，12周時DM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高，并呈時間依賴性。
　　2. 2周糖尿病大鼠心肌Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　WB實驗結(jié)果表明，2周DM大

7、鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc蛋白的表達(dá)相對于ND組明顯增加(P＜0.01)，但DKK1的表達(dá)變化不明顯。IHC結(jié)果顯示，ND組大鼠心肌中各蛋白表達(dá)均勻分布，DM組大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc的表達(dá)均明顯增加，其中β-catenin伴隨少量核表達(dá)，c-Myc在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)均增加。
　　3. 4，8，12周糖尿病大鼠心肌Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白及其mRNA的表達(dá)

8、>　　實驗結(jié)果顯示DM心肌中Wnt2，β-catenin和c-Myc的表達(dá)在4，8，12周時隨著DCM的發(fā)展逐漸增加（P＜0.01），其mRNA水平也逐漸增加(P＜0.05)，而TCF4及其mRNA水平僅在8周和12周時表達(dá)高于ND組（P＜0.01）。其中，β-catenin在4周DM心肌中表達(dá)增加，并開始進(jìn)入細(xì)胞核，在8周和12周時，其細(xì)胞核表達(dá)逐漸增加并伴隨細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)的減少(P＜0.01);而c-Myc在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)隨著

9、DCM的發(fā)展均逐漸增加(P＜0.01)。DKK1及其mRNA的水平在4周DM心肌中表達(dá)明顯高于ND組，隨后隨著信號通路的激活在8周和12周時表達(dá)顯著性降低但仍高于ND組(P＜0.01)。此外，P-GSK3β(Ser9)在4周DM大鼠心肌中表達(dá)無明顯增加，但在8周和12周時其表達(dá)逐漸增加，并伴隨GSK3βmRNA水平的降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論：1. STZ誘導(dǎo)的大鼠成模后，心肌凋亡細(xì)胞增加，伴隨明顯的心肌細(xì)胞壞死、心肌肥大和