WNT5A-ROR2信號(hào)通路在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 ROR2在卵巢癌組織中的表達(dá)及與WNT5A相關(guān)性的研究
　　研究目的:
　　檢測(cè)ROR2在卵巢組織中的表達(dá)，分析其與卵巢腫瘤患者臨床病理特征的關(guān)系以及與WNT5A表達(dá)的相關(guān)性，初步探討ROR2在卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ROR2基因在組織芯片(編號(hào)OV1005a和OV808)中的表達(dá)，組織包括3例正常卵巢，1

2、8例良性卵巢腫瘤，7例交界性卵巢腫瘤，45例原發(fā)卵巢惡性腫瘤及50例卵巢轉(zhuǎn)移癌。并通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析ROR2的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ROR2和WNT5A在36例原發(fā)性漿液性卵巢癌中的表達(dá)，Spearman檢測(cè)分析其相關(guān)性。
　　研究結(jié)果:
　　1.ROR2在正常卵巢、良性卵巢腫瘤、卵巢惡性腫瘤和卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)
　　在正常卵巢和良性卵巢腫瘤中主要在細(xì)胞漿中表達(dá)，

3、在交界性卵巢腫瘤、卵巢惡性腫瘤及卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中，ROR2在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。ROR2在正常卵巢和良性卵巢腫瘤、交界性卵巢腫瘤、卵巢惡性腫瘤及卵巢轉(zhuǎn)移癌陽性表達(dá)率逐漸升高，依次為28.57％(6/21)、57.14％(4/7)、60.00％(27/45)和96.00％(48/50)。ROR2在卵巢惡性腫瘤及卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)顯著高于在正常卵巢和良性卵巢腫瘤中的表達(dá)。（卵巢惡性腫瘤:p=0.0174，卵巢轉(zhuǎn)移癌組織:p＜0.0

4、001）;卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)顯著高于卵巢惡性腫瘤中的表達(dá)，p＜0.0001。
　　2.ROR2在卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)和OC臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性
　　ROR2基因在卵巢惡性腫瘤細(xì)胞分化G1、G2和G3組的陽性表達(dá)率分別為57.69％(15/26)、86.66％(39/45)和87.50％(21/24);細(xì)胞分級(jí)G2/G3組的陽性表達(dá)顯著高于G1組(1vs2，p=0.0058;1vs3，p=0.0190)。ROR2基因

5、在卵巢惡性腫瘤中Ⅰ/Ⅱ期的陽性率為62.85％(22/35)，Ⅲ/Ⅵ期的陽性率為50％(5/10)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性(p＞0.05）。ROR2基因的表達(dá)與患者年齡亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＞0.05。
　　3.ROR2和WNT5A在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及其相關(guān)性
　　ROR2和WNT5A在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。在ROR2強(qiáng)陽性表達(dá)的16例組織中，WNT5A強(qiáng)陽性表達(dá)有12例，占75％;在ROR2中等陽

6、性表達(dá)的12例組織中，WNT5A中等陽性表達(dá)有7例，占58.3％;在ROR2弱陽性表達(dá)的6例組織中，WNT5A弱陽性表達(dá)有5例，占83.3％;在ROR2陰性表達(dá)的2例組織中，WNT5A全部陰性表達(dá)，占100％。
　　研究結(jié)論:
　　1.ROR2在卵巢惡性腫瘤及卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中高表達(dá)，尤其在卵巢轉(zhuǎn)移癌組織中顯著上調(diào)，表明ROR2可能參與了卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程，并作為癌基因參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
　　2.在卵巢惡性腫瘤中R

7、OR2的表達(dá)與組織分化程度相關(guān)，與病理分期及年齡無關(guān)。
　　3.ROR2與WNT5A在漿液性卵巢癌中的表達(dá)具有相關(guān)性。
　　第二部分 靶向沉默ROR2對(duì)人卵巢癌細(xì)胞侵襲力影響的研究
　　研究目的:
　　探討靶向沉默ROR2的表達(dá)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲能力的影響及機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)ROR2蛋白在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、A2780、3AO和OVCA

8、R3中的表達(dá)。
　　2.應(yīng)用外源性重組WNT5A蛋白預(yù)處理ROR2相對(duì)低表達(dá)的3AO和OVCAR3細(xì)胞;應(yīng)用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)siRNA-ROR2（siROR2）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ROR2高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780;采用Western blot和免疫熒光染色來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROR2和WNT5A的表達(dá)變化。
　　3.應(yīng)用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)shRNA-ROR2質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SKOV3、A2780細(xì)胞，通過Western blot技術(shù)

9、和細(xì)胞免疫熒光法驗(yàn)證干擾效果;CCK實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ROR2表達(dá)水平的改變對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響;細(xì)胞劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力;Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)分子及WNT5A/ROR2信號(hào)通路下游因子的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.ROR2在SKOV3和A2780細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于在3AO和OVCAR3細(xì)胞的表達(dá)(p＜0.01)。但其在SKOV3和A2780細(xì)胞、3AO和OVCAR3

10、細(xì)胞間的表達(dá)均無顯著差異(p＞0.05)。
　　2.轉(zhuǎn)染siROR2能顯著降低ROR2基因在SKOV3和A2780細(xì)胞中的表達(dá)(p＜0.01)，然而，WNT5A的表達(dá)水平不受siROR2干擾的影響(p＞0.05):細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示ROR2的熒光表達(dá)在轉(zhuǎn)染組顯著降低，而WNT5A的熒光表達(dá)無明顯改變。
　　3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的三條shROR2質(zhì)粒均顯著降低了ROR2基因在SKOV3和A2780細(xì)胞中的表達(dá)(p＜0.01)。細(xì)胞免

11、疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示:在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shROR2質(zhì)粒的SKOV3和A2780細(xì)胞中ROR2基因的熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照組相比顯著降低。
　　研究結(jié)論:
　　1.ROR2基因在SKOV3、A2780、3AO和OVCAR3細(xì)胞中均有表達(dá)，且在SKOV3、A2780細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于其在3AO和OVCAR3細(xì)胞中的表達(dá)。
　　2.ROR2與WNT5A基因在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)具有相關(guān)性，ROR2基因受WNT5A基因表達(dá)變化的影響，而

12、WNT5A基因不受ROR2基因表達(dá)變化的影響。
　　3.ROR2基因在卵巢癌中可能作為促癌基因參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性生物學(xué)行為，這可能主要通過激活非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而發(fā)生。
　　第三部分 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shROR2細(xì)胞系及人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建
　　研究目的:
　　構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shROR2的SKOV3細(xì)胞系及其裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討ROR2的表達(dá)對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲

13、、粘附、細(xì)胞形態(tài)及腫瘤形成的影響。
　　研究方法:
　　1.應(yīng)用G418篩選轉(zhuǎn)染shROR2質(zhì)粒和NC(陰性對(duì)照組)質(zhì)粒后的SKOV3細(xì)胞，建立穩(wěn)定沉默ROR2表達(dá)的SKOV3細(xì)胞系(SKOV3-shROR2)和其陰性對(duì)照組細(xì)胞系(SKOV3-NC)。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光表達(dá)并通過Western blot檢測(cè)ROR2在兩組細(xì)胞中的表達(dá)變化，以判斷穩(wěn)篩效果。
　　2.倒置顯微鏡觀察拍攝細(xì)胞形態(tài)及消化狀態(tài)的變化。

14、r>　　3.應(yīng)用CCK、克隆形成、細(xì)胞劃痕、Transwell小室實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)ROR2表達(dá)水平的改變對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默表達(dá)ROR2基因的SKOV3細(xì)胞系經(jīng)G418篩選，四周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shROR2的SKOV3細(xì)胞系，命名為SKOV3-shROR2，同時(shí)構(gòu)建其陰性對(duì)照組的SKOV3細(xì)胞系(SKOV3-NC)。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):＞90％的SKOV3細(xì)胞顯

15、示質(zhì)粒載有的綠色熒光。同時(shí)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ROR2在SKOV3-shROR2細(xì)胞系中的表達(dá)較SKOV3-NC細(xì)胞系顯著降低(p＜0.01)。
　　2.穩(wěn)定沉默ROR2基因?qū)KOV3細(xì)胞形態(tài)及消化狀態(tài)的影響在穩(wěn)篩過程中，通過倒置顯微鏡對(duì)SKOV3-NC和SKOV3-shROR2細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，SKOV3-shROR2細(xì)胞系失去了成纖維樣細(xì)長(zhǎng)的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)而變成上皮樣的圓鈍的形態(tài);在胰蛋白酶消化過程中觀察

16、發(fā)現(xiàn)，與SKOV3-NC細(xì)胞相比，SKOV3-shROR2細(xì)胞較易從培養(yǎng)皿壁上消化下來，且懸浮于培養(yǎng)液中的細(xì)胞粘連成較大的細(xì)胞團(tuán)，表明其與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性較弱，但細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附地更為緊密。
　　3.穩(wěn)定沉默ROR2基因?qū)KOV3細(xì)胞增殖能力的影響通過CCK8行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:SKOV3-shROR2細(xì)胞系的增殖能力較陰性對(duì)照組細(xì)胞系顯著下降(p＜0.01)，但在24h的時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞增殖能力無明顯改變(p＞0.05

17、)。通過克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ROR2對(duì)SKOV3細(xì)胞群體依賴性和增殖能力的影響，結(jié)果顯示:與SKOV3-NC相比，SKOV3-shROR2細(xì)胞在克隆數(shù)量顯著減少(p＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　1.穩(wěn)定沉默ROR2基因表達(dá)的SKOV3細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了間質(zhì)樣向上皮樣的改變，進(jìn)一步表明ROR2基因可能參與卵巢癌的EMT發(fā)生過程。
　　2.穩(wěn)定沉默ROR2基因表達(dá)的SKOV3細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附性較弱，而細(xì)胞與細(xì)胞之間粘附