DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因MDC1和YAP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、文章分為兩步進行闡述
　　第一部分 DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因MDC1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究
　　目的：
　　近年來在對其它腫瘤的研究中，MDC1被發(fā)現(xiàn)可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。有研究指出MDC1參與食管癌細胞增殖和細胞周期調(diào)控，并對化療藥物阿霉素和順鉑的敏感性產(chǎn)生影響，提示MDC1可以作為食管癌的一個潛在治療靶點。而Yuan等通過干擾MDC1也驗證了MDC1對宮頸癌細胞增殖、細胞周期調(diào)控和阿霉素藥物敏感性

2、的影響，提示其調(diào)控宮頸癌發(fā)展過程中的重要進程。另外，MDC1在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中同樣發(fā)揮著重要作用。這些研究進一步支持了我們的推測，表明MDC1可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。對MDC1的研究，將有助于我們更好地理解卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程的分子機制，并有可能為卵巢癌的治療提供新的靶點，以改善卵巢癌的預(yù)后。
　　方法：
　　本課題為了探究MDC1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，首先從組織學(xué)角度檢測MDC1表達水平與預(yù)后的

3、關(guān)系。然后從體外實驗角度，通過上調(diào)和下調(diào)目的基因MDC1的表達水平，進而研究其發(fā)生的生物學(xué)行為改變，如MDC1在卵巢癌中是否起到調(diào)節(jié)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的作用，是否影響腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等，并在體內(nèi)實驗水平進一步驗證體外實驗結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　1.MDC1表達水平與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系
　　為探究卵巢癌中MDC1表達水平與預(yù)后的關(guān)系，我們對130例卵巢癌石蠟組織切片進行免疫組化檢測，根據(jù)其表達水平分為MDC1高表達和低表達組，

4、并進行生存分析。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明，MDC1高表達組明顯較MDC1低表達組預(yù)后差(P=0.0052)。通過對MDC1高表達和低表達組之間患者年齡、FIGO分期等潛在相關(guān)因素的進一步分析，我們發(fā)現(xiàn)MDC1高表達組年齡較低表達組偏低(P=0.043)，而與其他因素則無明顯相關(guān)性。
　　2.MDC1干擾及過表達細胞系的構(gòu)建
　　我們成功構(gòu)建了MDC1干擾載體pGIPZ-shMDC1和過表達載體pLenti

5、-MDC1，并從mRNA和蛋白水平檢測MDC1在卵巢癌不同細胞系中的表達，選取MDC1表達水平較高的HO8910PM和OVCAR3細胞系進行干擾，選取MDC1低表達細胞系HO8910進行過表達，通過細胞轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定篩選等方法獲得MDC1干擾及過表達的卵巢癌細胞系。
　　3.MDC1增強卵巢癌細胞的遷移和侵襲能力
　　我們利用Transwell實驗檢測MDC1干擾及過表達后對細胞遷移侵襲能力的影響。結(jié)果顯示MDC1干擾細胞系sh

6、MDC1-HO8910PM和shMDC1-OVCAR3的遷移和侵襲能力明顯降低，而過表達細胞系MDC1-OVE-HO8910的遷移和侵襲能力則顯著增強。證明MDC1在卵巢癌中具有促進腫瘤遷移侵襲的能力。
　　4.MDC1促進卵巢癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)
　　通過對MDC1干擾及過表達細胞系的形態(tài)學(xué)觀察，我們發(fā)現(xiàn)過表達MDC1的卵巢癌細胞系與對照細胞相比

7、呈梭形間葉性細胞形態(tài)，而MDC1干擾細胞系與對照細胞相比則趨向于多邊形上皮樣形態(tài)，提示MDC1可能促進卵巢癌細胞系的EMT。
　　Western Blot及細胞免疫熒光結(jié)果提示，MDC1干擾后上皮性標(biāo)志分子E-cadherin(E鈣黏蛋白)表達上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin(N鈣黏蛋白)等表達下調(diào)，MDC1過表達細胞系則相反，這進一步驗證了MDC1能夠促進卵巢癌細胞的EMT。
　　5.體內(nèi)實驗驗證MDC1促進卵巢癌

8、遷移侵襲能力
　　用MDC1干擾細胞系shMDC1-HO8910PM建立裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型，從體內(nèi)實驗水平驗證MDC1對卵巢癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力的影響。實驗結(jié)果顯示shMDC1-HO8910PM組的裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯少于對照組，這從體內(nèi)實驗的角度證實了MDC1促進卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移。
　　6.MDC1不影響卵巢癌細胞系的細胞周期和凋亡流式細胞術(shù)檢測細胞周期改變，發(fā)現(xiàn)小干擾RNA(siRNA)干擾MDC1后卵巢癌細胞系周期分布與對

9、照細胞相比并無明顯變化。同理，siRNA干擾MDC1后用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)干擾后卵巢癌細胞凋亡數(shù)量與對照細胞相比也無明顯改變。以上結(jié)果說明MDC1并不影響卵巢癌細胞的細胞周期和凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.MDC1的表達水平與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，MDC1高表達提示預(yù)后較差。
　　2.MDC1通過增強上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移。
　　3.MDC1不影響卵巢癌細胞周期和凋亡，且與CDDP和ADR藥物敏

10、感性無關(guān)。
　　第二部分 DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因YAP1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究
　　目的：
　　結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究結(jié)果，我們推測對YAP1的研究將有助于解釋卵巢癌細胞生長機制，同時為卵巢癌臨床治療提供新的靶點。
　　方法：
　　通過免疫組化檢測YAP1在卵巢癌組織中的表達，分析YAP1表達位置、表達水平與預(yù)后的關(guān)系。通過上調(diào)和下調(diào)YAP1基因的表達水平，對YAP1干擾和過表達后細胞的生物學(xué)

11、行為改變進行研究，檢測YAP1在卵巢癌中是否起到促進腫瘤增殖的作用。MTT實驗檢測YAP1是否調(diào)節(jié)卵巢癌細胞系對CDDP的敏感性。最后通過實時定量PCR實驗對YAP1下游靶基因進行初步篩選。
　　結(jié)果：
　　1.YAP1核表達水平與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系
　　為探究卵巢癌中YAP1表達水平與預(yù)后的關(guān)系，我們對76例卵巢癌石蠟組織切片進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)YAP1在胞漿和胞核中均有表達，根據(jù)YAP1核表達水平分為YAP1核高表

12、達和YAP1核低表達組，根據(jù)YAP1胞漿表達水平分為YAP1胞漿高表達和YAP1胞漿低表達組，并分別進行生存分析。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明，YAP1核高表達組與YAP1核低表達組相比其預(yù)后明顯較差(P=0.0163)，而YAP1在胞漿中的表達則與預(yù)后無關(guān)(P=0.7143)。將YAP1在胞漿與胞核中的表達結(jié)合起來，對卵巢癌預(yù)后有較好的預(yù)測作用(P=0.0001)。
　　2.YAP1在卵巢癌組織及細胞系中的蛋白表

13、達水平檢測
　　通過免疫組化和Western Blot方法，檢測YAP1在正常輸卵管傘組織和卵巢癌組織中蛋白表達水平。結(jié)果顯示YAP1在卵巢癌中的表達較正常輸卵管傘組織明顯升高。Western Blot檢測YAP1在卵巢癌細胞系及正常細胞系中的表達發(fā)現(xiàn)，YAP1在卵巢癌細胞系中的表達顯著高于永生化的正常輸卵管細胞系(FTE187)。
　　3.YAP1干擾及過表達細胞系的構(gòu)建
　　我們成功構(gòu)建了YAP1的干擾載體pLKO

14、.1-shYAP1和過表達載體pBABE-YAP1，結(jié)合YAP1在不同卵巢癌細胞系中的蛋白表達水平，選取YAP1表達水平較高的HO8910和HEY細胞系進行干擾，選取YAP1低表達細胞系A(chǔ)2780和SKOV3進行過表達。通過細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定篩選的方法，獲得YAP1干擾及過表達的卵巢癌細胞系。
　　4.YAP1增強卵巢癌細胞系的增殖能力
　　利用增殖相關(guān)實驗檢測YAP1干擾及過表達后對細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP1干擾細胞系s

15、hYAP1-HO8910和shYAP1-HEY的增殖能力明顯降低，而過表達細胞系YAP1-OVE-A2780和YAP1-OVE-SKOV3的增殖能力則顯著增強，證明YAP1在卵巢癌中具有促進腫瘤增殖的能力。
　　5.YAP1降低卵巢癌細胞系對CDDP的藥物敏感性
　　通過MTT法檢測YAP1過表達細胞系與對照細胞系對CDDP藥物敏感性的差別，結(jié)果顯示與對照組細胞相比，YAP1過表達細胞系對CDDP藥物敏感性降低。Wester

16、n Blot檢測相關(guān)通路分子，結(jié)果提示YAP1對CDDP藥物敏感性的影響可能與pJNK的上調(diào)和pATF2的下調(diào)有關(guān)。
　　6.YAP1下游靶基因篩選
　　通過調(diào)控YAP1的表達情況，用實時定量PCR方法檢測YAP1替在下游靶基因，最終篩選出ATF2、RAD51AP1和MYCL1等基因在多個細胞系中的表達與YAP1具有相關(guān)性，提示其可能為YAP1的下游靶基因。
　　結(jié)論：
　　1.YAP1在卵巢癌中高表達，其核蛋白