Wnt-β-catenin信號途徑在骨肉瘤發(fā)生中作用的研究.pdf

1、[研究背景]
　　 骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,主要發(fā)生于青少年,常累及長骨干骺端,如股骨遠(yuǎn)端或肱骨、脛骨的近端。在青少年生長發(fā)育時,長骨的干骺端代謝活躍,而骨肉瘤常常發(fā)生于此,提示骨肉瘤的發(fā)生可能與快速骨生長有關(guān)。自本世紀(jì)70年代采取術(shù)前化療以來,病人5年生存率得到明顯提高。但近30年來,無論嘗試新化療藥物或聯(lián)合化療,病人生存率沒有得到提高。對于診斷時已有肺轉(zhuǎn)移或術(shù)后復(fù)發(fā)的病人,愈后更差。現(xiàn)階段對骨肉瘤的發(fā)生的分子學(xué)機制

2、了解甚少,制約了新的靶向治療的開展。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號途徑在骨的發(fā)育中扮演重要角色。Wnt信號途徑包括β-catenin依賴途徑,即經(jīng)典型Wnt信號通路和β-catenin非依賴途徑,即所謂的非經(jīng)典Wnt信號途徑(包括Wnt/Ca2+和Wnt/JNK途徑)。許多研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典型Wnt信號途徑是骨骼發(fā)生的重要調(diào)控因素,而非經(jīng)典型Wnt通路的作用尚不清楚。因此,本研究主要涉及經(jīng)典型Wnt信號途徑。
　　 Wnt信號

3、途徑活化是間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化所必須的條件之一。后來,它通過調(diào)節(jié)骨原細(xì)胞的增值和分化來參與調(diào)控骨的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)在成年小鼠的骨原細(xì)胞中,Wnt信號途徑是活化的。骨肉瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)是高度異性的腫瘤細(xì)胞伴有腫瘤樣骨樣基質(zhì),腫瘤樣骨樣基質(zhì)類似正常成骨中的骨基質(zhì),提示腫瘤細(xì)胞可能來自骨細(xì)胞,但失去終末分化的能力。Wnt信號途徑活化是正常骨發(fā)育的重要因素,但它是否參與骨肉瘤的形成尚不清楚。
　　 大量研究證明Wnt信號途徑成員的突變導(dǎo)致

4、過度活化的Wnt信號通路促進(jìn)內(nèi)胚層上皮細(xì)胞來源的腫瘤發(fā)生,如腸道腫瘤。但是關(guān)于Wnt信號途徑在中胚層間充質(zhì)細(xì)胞起源的骨肉瘤發(fā)生中的作用尚不清楚。早先研究根據(jù)在骨肉瘤標(biāo)本中檢測到Wnt配體或細(xì)胞膜/漿β-catenin表達(dá),推測活化的Wnt信號途徑促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生。但這種研究方法存在一定缺陷,因為復(fù)雜的Wnt信號通路由多個配體、受體、共同受體及細(xì)胞抑制因子組成,僅檢測Wnt家族一員如Wnt配體不足以證明Wnt信號途徑是激活的,而β-cat

5、cnin進(jìn)入細(xì)胞核是Wnt信號活化重要標(biāo)志,因此檢測細(xì)胞核β-catenin的表達(dá)是證明Wnt信號途徑活化的可信方法。
　　 大量研究發(fā)現(xiàn)激活Wnt信號通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向骨細(xì)胞分化,因而對Wnt信號通路的干預(yù),成為治療骨質(zhì)疏松新的藥物靶點或骨組織再生工程學(xué)的研究熱點。以往的研究表明Wnt信號通路的過度激活與某些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),因此這些研究最大的擔(dān)憂是激活Wnt信號途徑是否會誘發(fā)骨腫瘤。本文通過研究Wnt信號途徑在骨肉瘤中

6、發(fā)生的作用,對于解除這一擔(dān)憂具有一定指導(dǎo)意義。
　　 本研究系統(tǒng)探討Wnt信號途徑在骨肉瘤發(fā)生中的作用,我們通過檢測細(xì)胞核β-catenin在骨肉瘤、骨肉瘤細(xì)胞系和骨母細(xì)胞瘤(良性骨腫瘤)中的表達(dá),同時檢測調(diào)節(jié)Wnt信號途徑對骨肉瘤細(xì)胞增殖和向骨細(xì)胞分化的影響。明確Wnt信號途徑在骨肉瘤的作用不僅有助于深入認(rèn)識骨肉瘤發(fā)生的機制,而且將為骨肉瘤的治療提供新的思路和理論依據(jù)。
　　 [研究目的]
　　 1.明確Wnt

7、信號途徑在骨肉瘤中狀態(tài)。
　　 2探索激活Wnt信號途徑對骨肉瘤細(xì)胞增值和分化的影響,為今后臨床治療骨肉瘤提供新思路。
　　 [研究方法]
　　 1.免疫組化方法檢測細(xì)胞核β-catenin在52例人骨肉瘤活檢組織、15例人骨母細(xì)胞瘤(良性骨腫瘤)標(biāo)本和骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)；
　　 2.運用Wnt熒光素酶報告基因檢測骨肉瘤細(xì)胞MG-63、SJSA-1、HOS和U-2-OS中Wnt信號途徑的活性,RT-PC

8、R方法檢測Wnt信號抑制劑DKK-1的表達(dá)；
　　 3.檢測GIN(GSK3β抑制劑)和配體Wnt3a是否能激活Wnt信號途徑:根據(jù)Wnt熒光素酶報告基因的活性、細(xì)胞核β-catenin的表達(dá)和Wnt信號通路的靶基因Axin2的表達(dá)的變化；
　　 4.MTS方法檢測激活Wnt信號途徑對骨肉瘤細(xì)胞增值的影響；
　　 5.通過檢測堿性磷酸酶活性(alkaline phosphatase,ALP)和骨原結(jié)節(jié)的形成(Al

9、izarin Red染色)探討激活Wnt信號途徑對骨肉瘤細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 1.Wnt信號途徑在骨肉瘤中失活
　　 首先運用免疫組織化學(xué)方法檢測β-catenin在骨肉瘤活檢標(biāo)本中的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤標(biāo)本中,在90％的標(biāo)本中細(xì)胞核β-catenin染色呈陰性,其余的10％標(biāo)本中β-catenin弱核陽性,而細(xì)胞膜或胞漿β-catenin陽性見于90％(47/52)標(biāo)本中。

10、在15例骨母細(xì)胞瘤中,β-catenin染色呈核強陽性,同時細(xì)胞漿/膜也陽性,但其中的破骨細(xì)胞β-catenin染色為陰性。
　　 在骨肉瘤細(xì)胞系中,我們運用Wnt熒光素酶報告基因檢測Wnt信號途徑的活性。在陽性對照結(jié)腸癌細(xì)胞SW480,糾正后的Wnt熒光素酶值為10左右,而在所有骨肉瘤細(xì)胞中,其值只有0.002～0.01(比SW480低1000～5000倍),這個數(shù)值與陰性對照pGL-3強度相似。Wnt熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

11、表明在骨肉瘤系中Wnt信號途徑處于失活狀態(tài)。免疫熒光檢測β-catenin結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有的骨肉瘤細(xì)胞系中,細(xì)胞核β-catenin染色陰性,這一結(jié)果也表明Wnt信號途徑是失活的。
　　 2.在骨肉瘤細(xì)胞中GIN激活Wnt信號途徑
　　 前面的結(jié)果顯示在骨肉瘤細(xì)胞中Wnt信號途徑失活,而Wnt信號途徑是正常骨細(xì)胞分化所必須的因素之一。因此,下一步檢測GIN和Wnt3a是否能夠激活Wnt信號途徑。GIN通過抑制GSK3β阻止

12、β-catenin的降解進(jìn)而激活Wnt信號途徑。在骨肉瘤細(xì)胞系MG-63、SJSA-1、HOS和U-2-OS中,GIN(0.2μM)處理24h后Wnt熒光素酶報告基因活性提高10-200倍(p<0.01)。同時,在DMSO對照組,免疫熒光顯示細(xì)胞膜β-catenin陽性,而在GIN處理所有的骨肉瘤細(xì)胞系后,細(xì)胞核β-catenin染色強陽性。與DMSO處理組相比,GIN(0.2μM)處理后的細(xì)胞Wnt靶基因Axin2 mRNA表達(dá)增加1

13、0-60倍(p<0.01)。Wnt3a是常用的Wnt配體,與受體結(jié)合后激活Wnt信號途徑。在陽性對照細(xì)胞C2C12中,50ng/ml和100ng/mlWnt3a處理后Wnt熒光素酶報告基因活性呈濃度依賴性增加,而在所有骨肉瘤細(xì)胞系中,Wnt3a作用后,未發(fā)現(xiàn)Wnt熒光素酶報告基因活性增加,同時也未發(fā)現(xiàn)Wnt3a作用后促進(jìn)細(xì)胞核表達(dá)β-catenin。
　　 3.DKK-1在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)
　　 前面的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GIN

14、能夠激活Wnt信號途徑,而Wnt3a卻不能,推測Wnt配體和受體的結(jié)合環(huán)節(jié)受到阻礙。為了進(jìn)一步探索導(dǎo)致Wnt信號途徑失活的因為,我們應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測Wnt抑制劑DKK-1 mRNA的表達(dá)。同Hela細(xì)胞相比,我們發(fā)現(xiàn)在MG-63、SJSA-1和HOS細(xì)胞中,DKK-1 mRNA的表達(dá)較高,但在U-2-OS細(xì)胞中未檢測到DKK-1mRNA的表達(dá)。
　　 4.激活Wnt信號途徑促進(jìn)骨原細(xì)胞分化
　　

15、 5.激活Wnt信號途徑抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖
　　 接下來,我們檢測激活Wnt信號途徑對骨肉瘤細(xì)胞增值的影響。與DMSO對照組相比,GIN(0.2μM)作用4天后對SJSA-1和HOS細(xì)胞增殖幾乎沒有影響,而在MG-63和U-2-OS,細(xì)胞增殖率只有對照組50％(p<0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 本研究首次報道Wnt途徑在骨肉瘤中是失活的,這一結(jié)論與以往的研究觀點不同。前人研究根據(jù)細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿β-ca

16、tenin的表達(dá)得出骨肉瘤中Wnt信號途徑激活的結(jié)論。
　　 本實驗結(jié)果顯示W(wǎng)nt信號途徑關(guān)鍵因子細(xì)胞核β-catenin在骨肉瘤標(biāo)本和骨肉瘤細(xì)胞中不表達(dá),而在骨母細(xì)胞瘤中細(xì)胞核β-catenin強陽性表達(dá),并且在骨肉瘤細(xì)胞中激活Wnt信號途徑抑制細(xì)胞增殖或促進(jìn)向骨原細(xì)胞分化,因此我們推測骨正常發(fā)育所必須的Wnt信號途徑的丟失是促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生因素。
　　 本研究對Wnt信號途徑失活的機制進(jìn)行初步探討。GIN在骨肉瘤細(xì)胞中