下調(diào)Wnt4基因后對胸腺瘤細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　通過構(gòu)建shRNA干擾下調(diào)人胸腺瘤細(xì)胞中Wnt4基因的表達(dá)，研究Wnt4基因?qū)π叵倭黾?xì)胞凋亡情況的影響。同時初步探索人胸腺瘤細(xì)胞中Wnt4基因發(fā)揮作用可能依賴的信號傳導(dǎo)通路。
　　方法：
　　1.根據(jù)shRNA設(shè)計的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，構(gòu)建針對Wnt4基因的4個干擾位點，合成相應(yīng)的序列片段，構(gòu)建shRNA- Wnt4干擾質(zhì)粒。經(jīng)鑒定片段成功插入后，用LipofectamineTM2000作為媒介分別轉(zhuǎn)染重組的四種干擾

2、質(zhì)粒和空白質(zhì)粒到體外培養(yǎng)的人胸腺瘤細(xì)胞。采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后Wnt4 mRNA表達(dá)，并在四個重組質(zhì)粒中挑選出對Wnt4基因抑制效果最好的干擾質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　2.將體外培養(yǎng)的人胸腺瘤細(xì)胞分成4組：空白對照組；lipo2000組；轉(zhuǎn)染TR001質(zhì)粒組；轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組。用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染48H，采用Wright’s-Giemsa’s混合染色、Hoechst-33342/PI熒光雙染色、流式細(xì)胞

3、學(xué)分析、Western blot等方法檢測人胸腺瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3.將體外培養(yǎng)的人胸腺瘤細(xì)胞分成3組：目的質(zhì)粒組、空質(zhì)粒（TR001）組、空白對照組；各組細(xì)胞按照分組處理后以 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒，采用RT-PCR及Western blot檢測細(xì)胞 Wnt4、JNK、β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.與相應(yīng)對照組比較，四種shRNA-Wnt4干擾質(zhì)粒中shR

4、NA-Wnt4-3抑制率為52.37％（P＜0.05）。作為抑制效果最佳的重組質(zhì)粒進(jìn)入下一步實驗。
　　2.與相應(yīng)對照組比較，經(jīng)過shRNA-Wnt4-3質(zhì)粒干擾后的人胸腺瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯升高（14.70±0.62、p<0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.Wnt4基因下調(diào)后人胸腺瘤細(xì)胞內(nèi)JNK基因表達(dá)也顯著下調(diào)（P＜0.01），且兩者變化趨勢一致。
　　結(jié)論：
　　1、shRNA-Wnt4-3質(zhì)粒能夠