人乳頭瘤病毒抑制FAS介導的凋亡通路在食管鱗狀細胞癌中的作用機制.pdf

1、目的：我國是食管癌（EsophagealCarcinoma，EC）的高發(fā)地區(qū)，每年因食管癌死亡者大約15萬人，約占全部惡性腫瘤死亡數(shù)的近四分之一。我國食管癌人口死亡率最低的為云南省(105/10萬)，與死亡率最高的河南省相差31倍，可見食管癌的發(fā)病率存在明顯的地域差異。近年來，環(huán)境致癌因素（如真菌毒素、病毒等）在各類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中已成為研究熱點之一。人類乳頭瘤病毒（HumanpapillomavirusHPV）與食管癌發(fā)生的關(guān)系最早是

2、1982年由Syrjanen提出，他的研究發(fā)現(xiàn)40％(24/60)的食管癌發(fā)生的組織學形態(tài)改變與生殖道濕疣改變極其相似，隨后他與同事用免疫組織化學法在食管鱗狀上皮細胞癌（EsophagealsquamousCellCarcinoma，ESCC）中發(fā)現(xiàn)了HPV的結(jié)構(gòu)蛋白。HPV作為重要致癌因素在宮頸癌發(fā)生中的作用已得到證實。隨著研究的深入，有學者發(fā)現(xiàn)口腔、食管鱗狀細胞癌的發(fā)生還與HPV感染有關(guān)。2008年，WHO認定HPV感染與人口咽部鱗

3、狀細胞癌發(fā)生存在直接關(guān)系。然而HPV與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生關(guān)系及其作用尚未闡明。
　　Fas屬于腫瘤壞死因子和神經(jīng)生長因子受體家族成員，當Fas與它相應配體FasL(CD95L)結(jié)合后，F(xiàn)as受體三聚體化而活化，激活的受體與FADD結(jié)合，再與caspase-8相互作用使后者活化，形成死亡誘導信號復合物，再激活一系列的Caspase-1,3,7等，其中Caspase-3的切割底物為PARP，調(diào)控凋亡最終步驟的執(zhí)行。FADD作為Fas

4、通路的關(guān)鍵蛋白，可以觸發(fā)凋亡級聯(lián)反應。研究發(fā)現(xiàn)在人結(jié)腸腺癌細胞系HCT116細胞中高表達HPV16E6，可以通過影響TRAIL蛋白介導的凋亡信號途徑，避免宿主細胞凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)HPVE6蛋白可以誘導FADD和caspase-8的泛素化，從而抑制Fas信號通路的激活來抑制細胞凋亡的發(fā)生。
　　我們在前期實驗中已經(jīng)了解到HPV感染可以降低食管鱗狀細胞癌中Fas蛋白的表達，為進一步明確HPV在食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先

5、明確我省食管鱗狀細胞癌組織中FADD、caspase-8蛋白的表達情況，分析HPV感染與FADD、caspase-8蛋白表達的關(guān)系，其次對正常食管上皮細胞和高分化食管鱗狀細胞癌細胞株轉(zhuǎn)染攜帶HPV16E6基因片段的質(zhì)粒，在過表達E6蛋白的情況下觀察Fas/FasL凋亡通路相關(guān)蛋白（Fas/FasL、FADD、caspase-8）的變化情況。在整體水平和細胞水平探討HPV對Fas介導的細胞凋亡通路相關(guān)蛋白的影響，從細胞凋亡角度進一步闡明H

6、PV與食管癌發(fā)生的關(guān)系及其作用機制，為食管癌發(fā)生的病毒學機制的研究提供新的思路和視角，為食管癌的臨床治療、預后判斷和預防提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　1、標本收集
　　收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院2009年1月到2015年12月間符合條件的食管鱗狀細胞癌（原發(fā)性食管鱗狀細胞癌，手術(shù)前未經(jīng)放療和化療）的石蠟標本，共159例。收集臨床病理資料，包括年齡，性別，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和癌組織的分化程度。
　　2、檢測病毒DNA<

7、br>　　將石蠟組織切成薄片，使用石蠟組織DNA提取盒提取組織DNA。
　　以HPVL1基因MY09/MY11為引物，用PCR方法檢測各實驗組與對照組中HPVL1基因的存在。使用?-actin作為內(nèi)參，使用三蒸水代替引物完成PCR反應，作為陰性對照，使用確診HPV陽性的宮頸癌石蠟組織提取的DNA作為陽性對照。
　　3、檢測食管鱗狀細胞癌組織的FADD、caspase-8蛋白表達情況
　　應用免疫組化SP法檢測食管鱗狀細

8、胞癌組織中FADD、caspase-8蛋白表達情況，F(xiàn)ADD、caspase-8蛋白陽性反應均定位于細胞質(zhì)。
　　4、EX-GS3066-M90(HPV16E6)、EX-NEG-M90(空載)質(zhì)粒提純及濃度檢測。
　　5、HPV16E6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的Het-1A（人正常食管上皮細胞）和Eca-109（人食管高分化鱗狀細胞癌株）的Fas介導凋亡通路相關(guān)蛋白（Fas/FasL、FADD、caspase-8）的影響。

9、　　體外培養(yǎng)Het-1A和Eca-109，轉(zhuǎn)染HPV16E6質(zhì)粒和空載質(zhì)粒（陰性對照），應用半定量RT-PCR、Westernblot方法分別檢測兩組Het-1A和Eca-109細胞FADD、caspase-8的mRNA和蛋白表達變化情況，分析HPV16E6蛋白對Fas凋亡通路的可能影響和機制。
　　為了進一步明確HPV16E6對人食管正常上皮Fas介導的凋亡通路的影響，轉(zhuǎn)染Het-1A后于12h、24h、48h收集細胞，觀察細胞

10、內(nèi)Fas/FasL、FADD和caspase-8蛋白表達在轉(zhuǎn)染后的變化趨勢。
　　6、統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗及Pearson相關(guān)分析法，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。計量資料以均數(shù)±標準差表示，單因素方差分析P<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.1食管鱗狀細胞癌（ESCC）病理形態(tài)學觀察結(jié)果與臨床病理分析
　　本組ESCC病例共159例，年齡跨度為2

11、7-87歲，中位數(shù)為62歲；男性患者124例，女性患者35例；經(jīng)病理形態(tài)學觀察：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者47例；ESCC高分化患者39例，中分化72例，低分化48例。低分化組與高中分化組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率無明顯差異（P>0.05）。
　　1.2ESCC組織中HPV的感染情況與臨床病理特征的關(guān)系
　　159例ESCC的HPV感染率為32.1%。HPV陽性組高中分化鱗癌占56.9%，明顯低于HPV陰性組的75.9%；HPV陽性組低分化鱗癌占4

12、3.1%，明顯高于HPV陰性組的24.1%（P<0.05）；HPV感染與年齡，性別，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯差異（P>0.05）。
　　2、免疫組化結(jié)果
　　2.1ESCC組織中FADD、caspase-8蛋白表達情況
　　159例ESCC組織中FADD蛋白表達陽性81例，陰性78例；caspase-8蛋白表達陽性93例，陰性66例。癌旁組織中FADD蛋白表達陽性150例，陰性9例；caspase-8蛋白表達陽性131例，

13、陰性28例。FADD和caspase-8在ESCC組織中蛋白表達的陽性率分別為50.9%和58.5%，明顯低于癌旁組織的94.3%和82.4%（P<0.05）。
　　2.2ESCC組織中FADD、caspase-8蛋白表達與HPV的關(guān)系
　　HPV陽性組FADD蛋白表達陽性19例，陰性32例，caspase-8蛋白表達陽性24例，陰性27例；HPV陰性組FADD蛋白表達陽性62例，陰性46例；caspase-8蛋白表達陽性6

14、9例，陰性39例，F(xiàn)ADD和caspase-8在HPV陽性組蛋白表達的陽性率分別為37.3%和47.1%，明顯低于陰性組的57.4%和63.9%（P<0.05）。
　　2.3ESCC組織中FADD和caspase-8蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系
　　男性FADD蛋白表達陽性率為59.7%，明顯高于女性的20.0%（P<0.05）；FADD蛋白表達與年齡，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度之間無明顯差異（P>0.05）。
　　男性

15、caspase-8蛋白表達陽性率63.7%，明顯高于女性的40.0%（P<0.05）；caspase-8蛋白表達與年齡，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度之間無明顯差異（P>0.05）。
　　2.4HPV與FADD和caspase-8蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系
　　HPV感染陽性的ESCC組織：62歲以上(包括62歲)患者FADD蛋白陽性表達率24.1%，明顯低于62歲以下患者的54.5%（P<0.05）；低分化組FADD蛋白陽性表

16、達率為13.6%，明顯低于高中分化的55.2%；FADD蛋白表達與性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯差異（P>0.05）。
　　HPV感染陽性的ESCC組織：低分化組caspase-8蛋白陽性率為27.3%，明顯低于高中分化組的62.1%（P<0.05），caspase-8蛋白表達與年齡，性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯差異（P>0.05）。
　　3、細胞實驗
　　轉(zhuǎn)染后HPV16E6、Fas、FasL、FADD、caspase-8

17、蛋白表達情況
　　3.1RT-PCR結(jié)果顯示：
　　Het-1A細胞轉(zhuǎn)染E6基因后與空載質(zhì)粒組相比，E6基因相對表達升高（P<0.05）；FADD、caspase-8基因相對表達量降低（P<0.05）；Fas基因相對表達量升高（P<0.05）；FasL無明顯變化（P>0.05）。
　　Eca-109細胞轉(zhuǎn)染E6基因后與空載質(zhì)粒組相比，E6基因相對表達量升高（P<0.05）；FADD、caspase-8、Fas基因相對表

18、達量升高（P<0.05）；FasL無明顯變化（P>0.05）。
　　Het-1A細胞轉(zhuǎn)染E6基因后與空載質(zhì)粒組相比，E6基因在12h、24h和48h相對表達量呈上升趨勢（P<0.05）；FADD和caspase-8基因在12h、24h和48h相對表達量呈下降趨勢（P<0.05）；Fas基因在12h、24h和48h相對表達量呈上升趨勢（P<0.05）；FasL無明顯變化（P>0.05）。
　　3.2Westernblot結(jié)果顯

19、示：
　　Het-1A細胞轉(zhuǎn)染E6基因后與空載質(zhì)粒組相比，E6蛋白相對表達升高（P<0.05）；FADD、caspase-8、Fas蛋白相對表達量降低（P<0.05）；FasL無明顯變化（P>0.05）。
　　Eca-109細胞轉(zhuǎn)染E6基因后與空載質(zhì)粒組相比，E6蛋白相對表達量升高（P<0.05）；FADD、caspase-8、Fas蛋白相對表達量降低（P<0.05）；FasL無明顯變化（P>0.05）。
　　Het-

20、1A細胞轉(zhuǎn)染E6基因后與空載質(zhì)粒組相比，E6蛋白在12h、24h和48h相對表達量呈上升趨勢（P<0.05）；FADD和caspase-8蛋白在12h、24h和48h相對表達量呈下降趨勢（P<0.05）；Fas蛋白在12h和24h相對表達量升高（P<0.05），在48h相對表達量降低（P<0.05）；FasL無明顯變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、本組食管鱗狀細胞癌組織HPV的檢出率為32.1%，HPV陽性的癌組織

21、中低分化鱗狀細胞癌所占比例高于HPV陰性組，提示HPV與腫瘤分化存在相關(guān)關(guān)系。
　　2、食管鱗狀細胞癌中FADD和caspase-8蛋白表達降低，而且HPV可進一步降低兩者的蛋白表達水平。
　　3、HPV16E6基因可以降低Het-1A和Eca-109細胞FADD、caspase-8、和Fas蛋白表達水平。
　　4、組織學和細胞學水平研究結(jié)果提示，HPV可能通過抑制FAS介導的凋亡通路，在食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一