ATF6在應力介導的成肌細胞凋亡與自噬中的作用及機制.pdf

1、目的：功能矯形作為青少年時期錯頜畸形主要治療手段，通過引發(fā)口腔頜面部軟組織發(fā)生適應性改建以達到矯治的目的。本實驗從微觀層面上著手，探討周期性張應力作用于成肌細胞產(chǎn)生的影響，并通過研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子ATF6在該過程的作用及其機制，進一步闡明功能矯形作用機制為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法：成功構(gòu)建大鼠L6成肌細胞的體外-力學刺激模型，細胞應用頻率為10cycles/min，拉伸變形率為15％的應力分別加載0h、2h、6h、12

2、h和24h，所有組的細胞應在相同條件下培養(yǎng)。應用DAPI熒光染色觀察細胞在不同應力加載時間其凋亡的情況；應用Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù)檢測對照組、各加力組以及加入3-MA抑制劑后不加力和加力24h的成肌細胞凋亡率；應用Western blot檢測LC3和p62的蛋白表達水平，并聯(lián)合應用3-MA抑制劑檢測應力對LC3和p62的蛋白表達水平影響；采用Real Time PCR檢測ATF6的干擾效率，并分別檢測siRNA干擾

3、ATF6前后的Bcl-2、Bax和Beclin1 mRNA的表達變化；應用Western blot檢測siRNA干擾ATF6前后的Bcl-2、Bax和Beclin1蛋白表達水平的變化，以明確ATF6在應力介導成肌細胞凋亡和自噬中的作用及機制，以上實驗結(jié)果均采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。
　　結(jié)果：
　　1.DAPI染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，周期性張應力可誘導成肌細胞凋亡，隨應力加載時間的延長凋亡率呈上升，

4、且在24h達13.36±0.5%。
　　2.經(jīng)RT-PCR結(jié)果顯示：隨應力加載時間的延長Bcl-2的mRNA表達量在加力2h開始逐漸下降，并在24h達最低值，而Bax的mRNA的表達量則與應力加載的時間呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢；Western blot檢測，Bcl-2/Bax的相對濃度與應力加載時間呈負相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　3.Western blot結(jié)果顯示：LC3II/I相對蛋白表達水平和Beclin1的

5、蛋白表達水平隨著應力加載時間的延長逐漸升高，而p62的蛋白在應力加載2h開始呈現(xiàn)逐漸遞減的趨勢，p<0.05。
　　4.流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)3-MA抑制劑組的細胞凋亡率明顯高于24h組，15.75±0.35%vs13.36±0.5%，p<0.05。
　　5.成功干擾成肌細胞內(nèi)的ATF6后，RT-PCR結(jié)果顯示：Bax和Beclin1表達量相對于24h組均明顯減少；而Bcl-2的表達量有明顯上升的趨勢，p<0.05。Wester

6、n blot結(jié)果顯示Bcl-2/Bax相對蛋白表達水平干擾組的高于與24h組，但是仍低于對照組的表達量；Beclin1的蛋白表達水平低于24h組的，p<0.05。
　　結(jié)論：
　　1.在細胞拉伸為15%幅度，10cycles/min的頻率的周期性張應力刺激下成肌細胞發(fā)生凋亡和自噬；
　　2.應力加載的時間與成肌細胞凋亡呈現(xiàn)相關(guān)性，隨應力加載時間的延長凋亡率逐漸升高；
　　3.成肌細胞自噬的強度與應力加載的時間呈正