ATF6在增加慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注損傷中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景:
　　缺氧是心血管疾病最常見的病理生理改變，長期慢性低氧不僅存在于高海拔地區(qū)，而且也常見于紫紺型先天性心臟病和慢性缺血性心臟病(chronic ischemia heartdisease，CIHD)。既往流行病學(xué)證據(jù)顯示長期居住在高海拔地區(qū)的人群有較少的CIHD發(fā)生率及更低的心臟疾病死亡率。一些動物實驗研究也表明，慢性間斷缺氧的心肌能更好的耐受急性缺血/缺氧損害。此外，長期臨床觀察也發(fā)現(xiàn)，某些紫紺型先心病患兒雖然心臟長期

2、被低氧的血液灌注，但在一定時期內(nèi)仍能存活，且很少發(fā)生心力衰竭，并能抵御心臟外科手術(shù)所致的缺血缺氧損害。上述現(xiàn)象表明長期慢性低氧可能誘導(dǎo)了心肌內(nèi)在的適應(yīng)性變化，且這種變化對心肌具有保護作用。然而，產(chǎn)生這種保護作用的機制尚不完全清楚，因此，深入研究慢些缺氧誘導(dǎo)心肌保護的分子機制將有益于提高心肌保護策略，改善心臟外科手術(shù)圍術(shù)期缺血缺氧所致心肌損害的治療水平。
　　低氧可導(dǎo)致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded pro

3、tein response，UPR)?；罨霓D(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6，ATF6)是一個由670個氨基酸組成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Ⅱ型跨膜蛋白質(zhì)，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。ATF6在反應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）時被裂解成具有活性的轉(zhuǎn)錄因子并轉(zhuǎn)移至細胞核，活化一系列內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)基因從而發(fā)揮作用。最新研究表明在慢性應(yīng)激時，ATF6具有促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

4、功能恢復(fù)并保護細胞免受慢性應(yīng)激損害，可見ATF6具有細胞保護及促細胞生存的特性。前期我們研究發(fā)現(xiàn)在紫紺型先心病患兒心肌組織ATF6持續(xù)活化，提示其可能在慢性缺氧心肌細胞內(nèi)發(fā)揮著維持自我適應(yīng)及保護作用。但是，其潛在保護作用及確切機制有待于進一步研究。
　　大量研究已闡明Akt，亦稱蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)在維持心肌細胞生存和心肌保護中的重要性。最近研究也發(fā)現(xiàn)慢性缺氧誘導(dǎo)了心肌細胞Akt的表達并參與了減輕

5、心肌細胞缺血缺氧/復(fù)氧損傷的保護機制。UPR和Akt通路長期以來被認為在特殊條件下具有調(diào)節(jié)和影響細胞命運的功能，但是作為UPR反應(yīng)分支之一的ATF6與Akt通路在功能上的聯(lián)系僅在最近才有所報道。然而，Akt是否涉及ATF6參與的慢性缺氧心肌耐受急性缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷尚未見報道。因而，需要進一步的實驗研究來闡明。
　　研究意義:
　　本研究擬構(gòu)建慢性缺氧刺激的動物模型，檢測慢性缺

6、氧心肌ATF6的表達情況;通過在體和離體動物實驗來驗證慢性缺氧刺激對心肌耐受急性I/R損傷的效果，進一步從細胞水平探討ATF6在慢性缺氧增加心肌耐受急性I/R損傷中的作用，并采用siRNA技術(shù)闡明ATF6可能通過調(diào)控Akt信號通路而發(fā)揮這種作用。
　　研究內(nèi)容:
　　1.構(gòu)建慢性缺氧刺激的動物模型并檢測ATF6在慢性缺氧心肌的表達。
　　實驗以健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠為研究對象，建立慢性缺氧動物

7、模型。將SD大鼠隨機分為兩組:常氧組和慢性缺氧組。常氧組大鼠在常氧環(huán)境(78％N2、21％O2)下喂養(yǎng)，缺氧組大鼠在模擬海拔5000米小動物低壓低氧艙內(nèi)喂養(yǎng)（艙內(nèi)大氣壓404mmHg、氧分壓84.98mmHg、溫度25℃）。4周后，獲取大鼠，檢測大鼠體重及心臟重量、血氧指標、血紅蛋白濃度及紅細胞比積來評估缺氧程度。采用免疫熒光染色及Western blot技術(shù)檢測缺氧心肌組織ATF6及其下游基因GRP78/Bip的表達情況。
　　

8、2.研究慢性缺氧刺激對心肌耐受急性I/R損傷的效果。
　　建立心肌急性I/R模型。通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立在體急性心肌I/R損傷模型，超聲測量兩組大鼠缺血前和再灌注24h后心功能變化、檢測血液心肌酶學(xué)指標變化以及TTC染色了解心肌壞死程度來評估慢性缺氧對心肌耐受急性I/R損傷的影響;以Langendorff灌流系統(tǒng)建立離體心臟急性I/R損傷模型，監(jiān)測兩組大鼠缺血前和再灌注后左心室內(nèi)壓力變化、檢測灌流液LDH活性以及TTC染色了

9、解心肌壞死程度來研究慢性缺氧在促心肌耐受急性I/R損傷中的作用。
　　3.探討ATF6在增加慢性缺氧心肌耐受急性I/R中的作用及可能機制。
　　利用H9c2心肌細胞株，建立慢性低氧細胞模型。將H9c2心肌細胞在氧濃度為13％O2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h，采用Western blot技術(shù)檢測上述5個不同時間點缺氧對心肌細胞內(nèi)ATF6、GRP78/Bip及Akt/p-Akt表達的影響。建立I/R細胞

10、模型，H9c2細胞分為常氧和低氧培養(yǎng)兩組，培養(yǎng)48h（即缺氧誘導(dǎo)ATF6表達最高時間點）后，將兩組H9c2細胞置于模擬的缺血培養(yǎng)液培養(yǎng)1h后轉(zhuǎn)移到常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3h，CCK-8細胞計數(shù)法檢測細胞活性了解細胞存活狀態(tài)，檢測釋放到培養(yǎng)基的LDH活性了解細胞壞死程度以評估缺氧對心肌細胞耐受急性I/R損傷的影響。采用siRNA技術(shù)，將siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到H9c2細胞在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后給予細胞模擬I/R處理，檢測細胞活性和培養(yǎng)基L

11、DH活性來說明ATF6在增加慢性缺氧耐受急性I/R損傷的作用;檢測細胞GRP78/Bip及Akt/p-Akt的表達變化，說明ATF6發(fā)揮此種作用的可能機制。
　　研究結(jié)果:
　　1.實驗前兩組大鼠體重無統(tǒng)計學(xué)差異，經(jīng)過4周缺氧暴露，慢性缺氧組大鼠體重、血氧分壓及氧飽和度明顯低于常氧組，而心臟重量、血紅蛋白水平、紅細胞比積及心臟重/體重則明顯高于常氧組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.在體大鼠急性I/R模型中，盡管慢性缺氧

12、導(dǎo)致心臟收縮功能有所下降，表現(xiàn)為缺血前低氧組大鼠EF及FS低于常氧組，分別給予兩組大鼠缺血30min隨之再灌注24h處理后，兩組大鼠心臟收縮功能均下降，但缺氧組EF及FS下降程度較常氧組小，且高于常氧組;再灌注24h后血清CK-MB活性低于常氧組，心肌梗塞面積小于常氧組，表明缺血前慢性缺氧處理能較好地保留I/R后心臟收縮功能，減少心肌損害。
　　3.Langendorff離體心臟灌流模型中，在缺血前慢性缺氧組心臟較常氧組心臟LVD

13、P要低，但經(jīng)30min缺血隨后再灌注的10min、20min、30min、40min、50min及60min各個時間點LVDP在缺氧組要明顯高于常氧組;再灌注60min后測定灌流液LDH活性及心肌梗塞面積均小于常氧組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明缺血前慢性缺氧處理能促進再灌注后心功能恢復(fù)，降低心肌I/R損害。
　　4.Western blot檢測慢性缺氧組大鼠心肌組織活化型ATF6α(50kDa)表達顯著高于常氧組，而且缺氧組左室及右

14、室心肌組織中ATF6α的表達無差異，免疫熒光檢測也顯示了低氧左室及右室心肌組織ATF6α的表達顯著增加。H9c2心肌細胞低氧培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATF6α于缺氧24h開始表達上調(diào)，與0h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且隨著缺氧時間的延長，其表達量也逐漸增加。Western blot檢測GRP78/Bip在心肌組織和H9c2心肌細胞的表達與ATF6α呈相同趨勢變化。
　　5.中度低氧培養(yǎng)誘導(dǎo)了心肌細胞ATF6

15、表達增加，采用siRNA-ATF6質(zhì)粒抑制ATF6表達后，低氧不能誘導(dǎo)ATF6α表達上調(diào)，選擇ATF6α高表達時間點給予H9c2心肌細胞模擬缺血1h后再灌注3h處理，檢測心肌細胞活力及培養(yǎng)基LDH活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)的心肌細胞在模擬缺血1h后再灌注3h其活力較常氧培養(yǎng)的心肌細胞要高，而LDH活性則低于常氧處理組。然而，利用siRNA干擾ATF6表達后同樣地給予細胞模擬I/R，則出現(xiàn)相反結(jié)果，即低氧培養(yǎng)的心肌細胞活力較常氧培養(yǎng)的心肌細胞

16、要低，LDH活性高于常氧處理組。結(jié)果表明，長時間低氧處理可以增加心肌細胞耐受隨后的急性I/R損傷，而且是ATF6參與了這種保護作用。
　　6.為了闡明ATF6參與慢性缺氧增加心肌細胞耐受急性I/R損傷的可能機制，我們檢測了Akt信號通路。發(fā)現(xiàn)中度低氧誘導(dǎo)了H9c2心肌細胞p-Akt表達上調(diào)，其表達變化規(guī)律與ATF6及Bip一致，利用siRNA干擾ATF6表達并低氧誘導(dǎo)48h后檢測p-Akt結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達被抑制。結(jié)果表明，ATF6參

17、與慢性缺氧增加心肌耐受急性I/R損傷的分子機制可能涉及到Akt信號通路。
　　研究結(jié)論：
　　1、本研究成功構(gòu)建了慢性缺氧大鼠模型。通過對大鼠體重、心臟重量、心臟重/體重、血氧指標、血紅蛋白濃度及紅細胞比積等生理參數(shù)變化來評估低氧程度，發(fā)現(xiàn)該模型比較符合紫紺型先心病的長期慢性缺氧特點，因此可將此模型用于紫紺型先心病缺氧相關(guān)的基礎(chǔ)研究。
　　2、慢性缺氧誘導(dǎo)了大鼠心肌組織及H9c2心肌細胞ATF6α及下游基因GRP78/

18、Bip的表達上調(diào)，在低氧培養(yǎng)的H9c2心肌細胞中隨著缺氧時間延長二者表達也逐漸增加。
　　3、在體大鼠急性I/R模型中，慢性缺氧能較好地保留大鼠心臟急性I/R后的心肌收縮功能，減少了心肌損害;Langendorff離體心臟灌流模型中，慢性缺氧預(yù)處理能促進大鼠心臟I/R后心功能恢復(fù)。慢性缺氧有助于增加心肌對急性I/R損傷的耐受。
　　4、慢性缺氧增加了H9c2心肌細胞耐受急性I/R損傷，ATF6參與了長時間慢性低氧誘導(dǎo)的這種心