NECA誘導(dǎo)抗心肌-缺血再灌注損傷保護(hù)作用的線粒體機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探討非選擇性腺苷受體激動劑5’-N-乙基酰胺基腺苷(5，-(N-ethylcarboxamid-o) adenosine，NECA)對缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion，I/R）損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其相關(guān)線粒體機(jī)制研究。
　　方法:
　　利用H9c2心肌細(xì)胞系建立模擬I/R損傷模型，采用CCK-8細(xì)胞活性測定試劑盒檢測細(xì)胞活性；通過線粒體膜電位檢測試劑盒（Mitochondrial

2、membrane potential assay kit with JC-1）檢測細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，△Ψm)；使用Amplex red過氧化氫/過氧化物酶試劑盒（Amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay kit）測定細(xì)胞內(nèi)H2O2水平，活性氧檢測試劑盒（Reactive oxygen species assay kit w

3、ith DCFH-DA）檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平，Mitosox red線粒體超氧化物指示劑（Mitosox red mitochondrial superoxide indicator）檢測線粒體內(nèi)ROS水平；利用復(fù)合體I酶活性檢測試劑盒（Complex I enzyme activity assay kit）檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合體 I的活性。
　　結(jié)果:
　　1.不同

4、濃度NECA（0.1、1、10μmol/L）對I/R后心肌細(xì)胞活性具有不同程度的保護(hù)作用(均P<0.05)，其中以1μmol/L時保護(hù)作用最為明顯，因此我們使用該濃度進(jìn)行后續(xù)實驗；
　　2. I/R后細(xì)胞活性明顯降低，NECA可抑制I/R后細(xì)胞活性的下降，而腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261、腺苷A2B受體拮抗劑MRS1706單獨(dú)或聯(lián)合使用均可阻斷NECA對細(xì)胞的保護(hù)作用(均P<0.05)，提示NECA通過激活腺苷A2A和A2B

5、受體發(fā)揮其抗I/R損傷心肌保護(hù)作用；
　　3. I/R后細(xì)胞JC-1紅綠熒光強(qiáng)度比值明顯降低，說明I/R導(dǎo)致△Ψm的顯著降低，提示I/R導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)的開放。NECA可抑制I/R后細(xì)胞△Ψm的改變，而腺苷A2A和A2B受體拮抗劑單獨(dú)或聯(lián)合使用均可抑制NECA對△Ψm的保護(hù)作用(均P<0.05)，提示NECA通過激活腺苷A2A和A

6、2B受體而發(fā)揮其抗I/R損傷心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制I/R損傷引起的mPTP的開放有關(guān)；
　　4. I/R損傷后細(xì)胞Amplex red、DCF、Mitosox red熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)，說明I/R使細(xì)胞以及線粒體ROS的含量增加。NECA可抑制I/R后細(xì)胞內(nèi)上述各熒光強(qiáng)度的增高，而腺苷A2A或A2B受體拮抗劑均可阻斷NECA的作用(均P<0.05)，提示NECA通過激活腺苷A2A和A2B受體來減少細(xì)胞及線粒體ROS的產(chǎn)生，

7、進(jìn)而發(fā)揮其心肌保護(hù)作用；
　　5. NECA可降低I/R后線粒體復(fù)合體I的活性，而腺苷A2A或A2B受體拮抗劑均可逆轉(zhuǎn)NECA對I/R損傷后細(xì)胞內(nèi)線粒體復(fù)合體I活性的影響(均P<0.05)，提示NECA激活腺苷A2A和A2B受體后產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用可能與抑制線粒體復(fù)合體I的活性有關(guān)；
　　6. Src酪氨酸激酶的選擇性抑制劑PP2可抑制NECA對I/R損傷后細(xì)胞活性的保護(hù)作用(P<0.05)，提示Src酪氨酸激酶可能介導(dǎo)NE

8、CA的心肌細(xì)胞保護(hù)；
　　7. Src酪氨酸激酶的選擇性抑制劑PP2可抑制NECA對I/R后細(xì)胞△Ψm的作用(P<0.05)，提示NECA抑制mPTP開放的作用可能與Src酪氨酸激酶的激活有關(guān)；
　　8.與NECA組相比，PP2+NECA組細(xì)胞Amplex red、DCF、Mitosox red熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)(均P<0.05)，提示NECA對I/R后細(xì)胞內(nèi)以及線粒體ROS增高的抑制作用可能與Src酪氨酸激酶的激活有關(guān)。<