流體剪切應力作用強度對內皮細胞Fractalkine表達水平的影響.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是多種心腦血管疾病的基礎，血液流動產生的剪切應力對內皮細胞形態(tài)和功能的影響在心血管系統疾病中起重要作用。在內皮細胞，已發(fā)現多種受剪切應力調節(jié)的基因，包括趨化因子。Fractalkine（FKN）是已發(fā)現的趨化因子CX3C亞家族僅有成員，因兼有趨化和粘附的特殊性，與多種炎癥性疾病相關，并且在體研究發(fā)現低剪切應力誘導形成的AS斑塊處FKN表達增加，大量研究也表明FKN對于AS的形成和

2、發(fā)展具有重要意義。
　　方法：1.原代臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng)：在新鮮（健康剖宮產產婦分娩后立即取新生胎兒臍帶，長度15-20cm，取標本時間≤4小時）臍靜脈內注0.1％的Ⅱ型膠原酶消化獲得內皮細胞，用M199生長液（含25%內皮細胞上漲因子，ECGS）進行培養(yǎng)，EA.HY926細胞株用M199生長液(無含ECGS)進行培養(yǎng)。為更合理的選擇研究對象，比較兩組細胞的光學顯微鏡及電子顯微鏡下形態(tài)、Ⅷ因子相關抗原免疫組化、細胞純度檢測CD3

3、1抗體表達及兩種細胞的增長曲線。
　　結果：⑴光學顯微鏡下形態(tài)觀察：原代HUVEC體外生長3～4d可鋪滿單層,細胞呈梭形、飽滿，漩渦狀排列生長,傳代后可見管腔樣結構；EA.HY926細胞株胞質多顆粒，2～3可鋪滿單層，可長成復層。⑵免疫組化結果分析：用Image-Pro Plus6.0軟件判斷Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色結果，原代HUVEC的平均光密度為4138.8±594.01，EA.HY926細胞株的平均光密度為2234.02±

4、78.78，T檢驗得出P﹤O.O1，兩者平均光密度差別有統計學意義，原代HUVEC的染色程度明顯比EA.HY926細胞株高。⑶電子顯微鏡下形態(tài)觀察：透射電鏡下，原代HUVEC里可發(fā)現較多的橫切與縱切的Webel-Palade小體，在EA.HY926細胞株較少。⑷細胞純度檢測：CD31抗體的表達率原代HUVEC細胞(85.36%)大于EA.HY926細胞株(70.82%)，進行t檢驗，P﹤0.001，兩種細胞CD31表達差異有統計學意義，

5、原代HUVEC高于EA.HY926細胞株。⑸原代細胞從48小時開始進入生長期，96小時達到高峰后，細胞開始衰老，趨向凋亡。EA.HY926細胞株48h開始進入生長期，96-120h達到高峰后，進入穩(wěn)定生長，生長幅度較小。
　　結論：臍靜脈注Ⅱ型膠原酶消化法配合M199生長液（含25%ECGS）可迅速獲取大量內皮細胞,其生物學特性明顯優(yōu)于EA.HY926細胞株,而細胞株由于細胞數量多，培養(yǎng)方法簡單，成活率高為特點，選用于較復雜，細胞

6、創(chuàng)傷較大的研究。2.為闡明內皮細胞Fractalkine mRNA及蛋白表達與剪切應力強度的關系，我們用不同強度的流體剪切應力(2.62，4.58，6.54，10.47，15.71，19.64dyne/cm2)處理培養(yǎng)的EA.HY926人臍靜脈內皮細胞株，然后采用熒光定量RT-PCR的方法檢測內皮細胞Fractalkine mRNA的表達量，采用雙抗體夾心ABC-ELISA技術檢測內皮細胞Fractalkine蛋白質的生成。
　　

7、結果：熒光定量FKN mRNA表達量，未處理組基礎表達量極少，為0.01±0.00，在剪切應力4.58dyne/cm2時的表達量最高，為1.92±0.22，進行單因素的方差分析，六組不同剪切應力之間總P＜0.05，4.58dyne/cm2與其余組的相差比較均為P＜0.05，差別有統計學意義。為了證明剪切應力強度與Fractalkine mRNA表達量之間的相關性，進行兩組相關性分析，結果r=-0.35，p＞0.05，兩組數據沒有相關性。

8、ELISA法測定Fractalkine的蛋白表達量，未處理組基礎表達量極少，為0.016±0.00，剪切應力4.58 dyne/cm2時的Fractalkine蛋白表達量最高，為0.15±0.04，進行單因素方差分析均與其他剪切應力下的蛋白表達量差異有統計學意義。為了證明剪切應力強度與Fractalkine蛋白表達量之間的相關性，進行兩組相關性分析，結果r=-0.33，p＞0.05，兩組數據沒有相關性。
　　結論：此結果提示剪切應