流體低剪切應(yīng)力作用時間對內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine表達(dá)水平的影響.pdf

1、目的：本研究旨在探索低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Fractalkine(FKN)基因、蛋白表達(dá)與作用時間的聯(lián)系，并初步探索ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)FKN表達(dá)上調(diào)的影響，為低剪切應(yīng)力通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究奠定基礎(chǔ)，為防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病為代表的心腦血管疾病提供線索。
　　方法：1.用M199生長液(含1％青鏈霉素合劑的M199培養(yǎng)基，10%的胎牛血清)培養(yǎng)EA.HY926細(xì)胞株。觀察光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下形態(tài)

2、，通過Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化、細(xì)胞純度檢測CD31抗體表達(dá)及細(xì)胞的增長曲線鑒定EA.HY926細(xì)胞株。2.選擇剪切應(yīng)力強(qiáng)度4.58 dyne/cm2不同時間（對照組，0.5，1，2，3，5，7，9，11h）分組處理EA.HY926細(xì)胞株。采用熒光定量RT-PCR方法檢測細(xì)胞中FKN mRNA的表達(dá)，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測灌流液中FKN的濃度。3.通過Western blot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)探索低剪切應(yīng)力對ERK1/2的激活。4.采用

3、熒光定量RT-PCR方法檢測細(xì)胞中FKN mRNA的表達(dá)研究ERK1/2阻斷劑對低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的EA.HY926人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株FKNmRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：1.⑴光學(xué)顯微鏡下形態(tài)觀察：EA.HY926細(xì)胞株生長2～3d可鋪滿單層，細(xì)胞呈梭形，漩渦狀排列生長，傳代后可見管腔樣結(jié)構(gòu)，可長成復(fù)層。⑵透射電鏡下形態(tài)觀察：發(fā)現(xiàn)橫切與縱切的Webel-Palade小體。⑶免疫組化結(jié)果觀察細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為棕黃色顆粒。⑷EA.HY926細(xì)

4、胞株生長曲線穩(wěn)定，適用于細(xì)胞實驗。2.4.58 dyn/cm2剪切應(yīng)力下處理不同時間，1h組FKNmRNA表達(dá)水平最高。0.5h、1h與無處理組、7h、9h、11h組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組之間差異不明顯。2h組灌流液蛋白表達(dá)水平最高。1h，2h，3h與無處理組、7h、9h、11h組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3.低剪切應(yīng)力（4.58 dyne/cm2）作用于EA.HY926人

5、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株后在觀察時間內(nèi)可引起ERK1/2蛋白磷酸化水平的升高，出現(xiàn)明顯的蛋白條帶。根據(jù)Quality One圖像分析系統(tǒng)測定分析得出隨時間增加ERK1/2磷酸化增強(qiáng)，10min時達(dá)到高峰，隨刺激時間延長而逐漸降低，1h低至0min水平以下，而總ERK1/2在各時間段的表達(dá)無明顯差異。內(nèi)參GAPDH的表達(dá)亦無明顯差異。細(xì)胞免疫熒光顯示未行剪切應(yīng)力處理時磷酸化的ERK1/2蛋白表達(dá)相對較低，低剪切應(yīng)力處理10min后，染色明顯，滿視

6、野分布綠色熒光區(qū)域，低剪切應(yīng)力作用30min后熒光又趨于變淡。4.低剪切應(yīng)力可上調(diào)EA.HY926細(xì)胞株FKN基因的表達(dá)，與未行任何處理的EA.HY926細(xì)胞株比較，有明顯統(tǒng)計學(xué)差異，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑阻斷劑PD98059可抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的EA.HY926細(xì)胞株FKN基因的上調(diào)。DMSO組與低剪切應(yīng)力處理組比較，無明顯差別。
　　結(jié)論：此結(jié)果提示剪切應(yīng)力誘導(dǎo)FKN表達(dá)隨處理時間延長逐漸上調(diào)，到達(dá)峰值后逐漸下降上調(diào)，具有早