miR-132在流體剪切力誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞骨向分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　錯合畸形是一類嚴(yán)重影響人類美觀和健康功能的疾病，正畸治療是解除此類畸形的主要手段，其核心機(jī)制是在機(jī)械應(yīng)力作用下，通過對牙周細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生定向牙齒移動，維持牙周組織的平衡。在此過程中細(xì)胞生物力學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制若發(fā)生異常，可破壞應(yīng)力狀態(tài)下牙周組織的正常改建，阻礙正畸牙齒移動或?qū)е卵例X松動脫落。
　　信號通路（如mTOR、Wnt、TGF-β、BMP等）在轉(zhuǎn)錄水平對細(xì)胞分化起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。而MicroRNA

2、(miRNA)的發(fā)現(xiàn)，又將細(xì)胞分化的調(diào)控?zé)狳c引入轉(zhuǎn)錄后水平時代。miRNA是一類長約19～24個核苷酸的小分子非編碼(Non-coding) RNA，它們能夠識別特定的靶基因，并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)。研究表明miRNA對細(xì)胞增殖和分化過程起到了重要的調(diào)控作用。在生物體內(nèi)，各種生命活動是以相互關(guān)聯(lián)的信號通路(Signaling pathway)來執(zhí)行的，彼此關(guān)聯(lián)的信號通路構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA更傾向于選擇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的蛋白作

3、為靶基因，因而能夠在轉(zhuǎn)錄后水平對信號通路進(jìn)行精確的調(diào)控。此外，miRNA因其靶基因數(shù)量龐大且種類繁多，能夠廣泛地參與到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用。因此，本課題擬通過體外培養(yǎng)PDLCs，采用流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs成骨分化模型，探討與PDLCs成骨相關(guān)miRNAs表達(dá)譜的建立及特異性miR-132的篩選與確定;研究miR-132在PDLCs骨向分化中的生物學(xué)作用以及miR-132調(diào)控PDLCs骨向分化的作用機(jī)制，為闡明機(jī)械應(yīng)力

4、對PDLCs功能調(diào)節(jié)機(jī)制，明確組織特異性細(xì)胞骨向分化的分子機(jī)制，揭示正畸牙周組織和牙槽骨改建機(jī)理具有重要的意義。
　　方法：
　　1、使用酶消化聯(lián)合組織塊法體外分離培養(yǎng)PDLCs;建立體外流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs成骨分化模型;檢測流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs骨向分化過程中Ca2+濃度，堿性磷酸酶表達(dá)，采用Real-time PCR和western blot技術(shù)檢測成骨相關(guān)因子表達(dá)，確定流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs骨向分化作用。

5、>　　2、采用Agilent公司的Whole Human Genome Array miRNA表達(dá)譜芯片對流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs成骨分化差異miRNAs進(jìn)行篩選;Real-time PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證;建立人PDLCs流體剪切力成骨誘導(dǎo)前后miRNAs表達(dá)譜;篩選及確定在PDLCs骨向分化過程中，發(fā)生特異性改變的miRNAs; Real-time PCR驗證特異性miRNA-miR132在PDLCs成骨分化過程中的表達(dá)時相。

6、r>　　3、通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)和抑制miR-132在PDLCs中的表達(dá)，采用Real-time PCR和Western blot技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞成骨分化能力的差異;明確miR-132對PDLCs骨向分化的調(diào)控作用;Western blot檢測過表達(dá)和抑制miR-132后，mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討miR-132調(diào)控PDLCs骨向分化可能的信號通路及之間的相互關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、體外培養(yǎng)PDLCs，觀察其

7、生物學(xué)特性，采用流體剪切力誘導(dǎo)其骨向分化，結(jié)果顯示流體剪切力可以促進(jìn)PDLCs成骨分化，Real-time PCR及Western blot檢測成骨相關(guān)基因均表明PDLCs的骨向分化能力增強(qiáng)。
　　2、基因芯片結(jié)果顯示，流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs成骨分化后58個miRNA表達(dá)水平發(fā)生了改變，選擇4個microRNA進(jìn)行Real-time PCR驗證芯片結(jié)果，芯片準(zhǔn)確性良好;同時發(fā)現(xiàn)其中以miR-132變化最為顯著。
　　3、通

8、過轉(zhuǎn)染miRNA載體來過表達(dá)或沉默miR-132發(fā)現(xiàn)，流體剪切力誘導(dǎo)的PDLCs成骨分化有所改變，說明miR-132對PDLCs成骨分化具有特異性的調(diào)控作用，這種作用可能是通過mTOR通路來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　　1、流體剪切力可以誘導(dǎo)體外PDLCs成骨分化。
　　2、miR-132在流體剪切力誘導(dǎo)PDLCs成骨分化過程中具有特異性表達(dá)。
　　3、miR-132可能是通過mTOR通路來調(diào)控流體剪切力誘導(dǎo)PDLC