流體剪切力影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、生物反應(yīng)器是近年來生物工程方面研究熱點(diǎn)之一，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞及組織復(fù)合物。灌注式生物反應(yīng)器不僅具有三維動(dòng)力性培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，而且其動(dòng)力性環(huán)境可對(duì)種子細(xì)胞產(chǎn)生流體剪切應(yīng)力(fluidshearstress，F(xiàn)SS)，因此在骨組織工程研究領(lǐng)域呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。骨骼的骨量和正常生理狀態(tài)的維持有賴于對(duì)骨骼施加適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激。研究表明骨骼基質(zhì)形變引起的細(xì)胞外液流動(dòng)所形成的FSS是作用于骨骼細(xì)胞的主要應(yīng)力。FSS對(duì)骨骼細(xì)胞正常生理活動(dòng)及增殖與分化

2、有著重要的作用。 平行平板流動(dòng)腔(parallel-plateflowchamber，PPFC)作為一種可以提供較精確液體層流的實(shí)驗(yàn)裝置，常被用于研究細(xì)胞流體力學(xué)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)被認(rèn)為是最有發(fā)展前景的骨組織工程種子細(xì)胞之一。hMSCs存在于骨髓基質(zhì)中，其生理環(huán)境與骨骼細(xì)胞類似，也應(yīng)是應(yīng)力敏感細(xì)胞，推測FSS作用于hMSCs后應(yīng)該產(chǎn)生與骨骼細(xì)胞相似的生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)平行

3、平板流動(dòng)腔進(jìn)行改良制作，利用其對(duì)hMSCs進(jìn)行FSS刺激，通過倒置顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞增殖通過MTT法及流式細(xì)胞儀檢測，成骨分化通過堿性磷酸酶和骨鈣素活性測定、堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色及四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記檢測。 我們通過觀察FSS刺激hMSCs體外增殖及向成骨方向分化的作用，為進(jìn)一步研究FSS刺激hMSCs體外增殖及分化的機(jī)制、利用灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)組織工程骨提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下：

4、 一、改良的平行平板流動(dòng)腔的制備及其優(yōu)點(diǎn)。流動(dòng)腔以有機(jī)玻璃作為流動(dòng)腔管道部分，塑料薄膜用來密封流動(dòng)腔和保持流動(dòng)腔高度，應(yīng)用塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶底作為細(xì)胞貼附載體，靜脈輸液管作為灌流液循環(huán)管道，以長尾夾固定和密封平行平板流動(dòng)腔。整個(gè)裝置以放射線輻照消毒滅菌。此模型較其它報(bào)道的流體剪切力刺激模型制作簡單，成本低廉，操作簡便。實(shí)驗(yàn)證明此系統(tǒng)作為hMSCs流體力學(xué)的研究模型是科學(xué)、可行的。 二、流體剪切力可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖。將傳代

5、的第三代hMSCs分為FSS刺激組和靜態(tài)培養(yǎng)對(duì)照組，應(yīng)用四氮噻唑鹽(MTF)比色法檢測細(xì)胞的增殖，繪制細(xì)胞生長曲線，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況。結(jié)果：強(qiáng)度為0.3Pa的FSS作用30min后的細(xì)胞增殖能力得到提高，實(shí)驗(yàn)組的hMSCs生長曲線較對(duì)照組前移；FSS(0.3Pa,30min)刺激hMSCs，24h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比(13.53±1.47)％，對(duì)照組細(xì)胞S期細(xì)胞百分比(7.56±2.54)％。

6、上述結(jié)果提示FSS對(duì)hMSCs的生物學(xué)效應(yīng)一個(gè)重要方面表現(xiàn)為FSS能夠顯著促進(jìn)hMSCs增殖，DNA合成加速(p＜0.01)。 三、流體剪切力可促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期分化。將傳代的第三代hMSCs分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組施加FSS(0.3Pa,30min)，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記、放免法測定骨鈣素的分泌情況和堿性磷酸酶(ALP)活性的測定。結(jié)果

7、：經(jīng)FSS(0.3Pa,30min)刺激后，hMSCs細(xì)胞胞體較對(duì)照組大，突起較多，多角形細(xì)胞較對(duì)照組增多。透射電鏡觀察提示：經(jīng)FSS刺激后的hMSCs呈現(xiàn)成熟細(xì)胞表現(xiàn)。FSS刺激組hMSCs的ALP活性第9d開始增高。隨時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性增高速度較對(duì)照組快，ALP染色成陽性，同對(duì)照組相比有顯著差異。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第12，24d都能檢測到骨鈣素表達(dá)，但兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。21d后，實(shí)驗(yàn)組hMSCs可形成小的形態(tài)不

8、典型的鈣化結(jié)節(jié)。上述結(jié)果提示：強(qiáng)度為0.3Pa作用30min的FSS可以使hMSCs早期的細(xì)胞內(nèi)ALP活性增高，促進(jìn)細(xì)胞早期分化，但未能促使晚期的骨鈣素表達(dá)升高，并且21d后形成的鈣結(jié)節(jié)不典型，說明此參數(shù)的FSS不能成功促進(jìn)hMSCs向成骨方向分化。 綜上所述，我們可以得出結(jié)論：經(jīng)過改良制作的平行平板流動(dòng)腔作為hMSCs流體力學(xué)的研究模型是科學(xué)、可行的；流體剪切力能夠促進(jìn)hMSCs增殖，使其生長曲線前移；流體剪切力能夠使hMSC