脈沖電磁場(chǎng)對(duì)脫鈣骨基質(zhì)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化的影響.pdf

1、背景和目的:脫鈣骨基質(zhì)(Demineralized Bone Matrix,DBM)具有在體外促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)增殖與成骨分化,在體內(nèi)促進(jìn)新骨形成的能力,在臨床組織工程中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。hMSCs具有良好的成骨細(xì)胞分化潛能和成骨活性,是骨組織工程種子細(xì)胞的最佳選擇之一,hMSCs與DBM共同培養(yǎng),與DBM釋放的可溶性骨生長(zhǎng)因子接觸后,能加速自身的增殖與成骨分化

2、。
　　 脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electromagnetic fields,PEMF)在矯形外科領(lǐng)域主要用于治療骨不連、骨延遲愈合及假關(guān)節(jié)形成等并已經(jīng)取得成功。特定頻率、特定場(chǎng)強(qiáng)的PEMF能夠刺激成骨細(xì)胞增殖、分化,并可刺激局部骨生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生,加速骨基質(zhì)礦化,該現(xiàn)象已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者們證實(shí)。然而有關(guān)PEMF和DBM共同刺激hMSCs增殖與成骨分化的具體生物學(xué)作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究將觀察PEMF對(duì)DBM誘導(dǎo)

3、hMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞增殖與成骨分化的影響,探討PEMF影響組織工程材料中hMSCs成骨分化的可能機(jī)制,為骨組織工程提供新的技術(shù)手段。
　　 方法:
　　 1.經(jīng)知情同意后,選取因股骨頸骨折行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭。
　　 2.將股骨頭鋸成3mm×5mm×5mm大小的骨粒,按Urist b法制作成DBM。用掃描電鏡觀察材料的形態(tài)并測(cè)量材料孔徑,能譜儀檢測(cè)DBM鈣含量。
　　 3.獲取健康志愿者的骨髓

4、,分離、培養(yǎng)hMSCs,進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。鑒定hMSCs的表面抗原標(biāo)志物CD44和CD105。
　　 4.第3代hMSCs以1×104個(gè)/孔接種至8塊24孔板,以1×105個(gè)/孔接種至2塊加蓋玻片的6孔板,各分成4組:細(xì)胞對(duì)照組(cell,C組)、細(xì)胞+材料組(cell-DBM,CD組)、細(xì)胞+脈沖電磁場(chǎng)組(cell-PEMF,CP組)、細(xì)胞+材料+脈沖電磁場(chǎng)組(cell-DBM-PEMF,CDP組),其中CD組和CDP組培養(yǎng)

5、板每孔放入一塊DBM材料,CP組和CDP組給予PEMF(4h/d,頻率15Hz,場(chǎng)強(qiáng)5Gs)照射。
　　 5.在第1、3、7、10、14天時(shí)用MTT法分析細(xì)胞的增殖活性;在第1、7、14、21天時(shí)采用ELISA方法檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、放免法檢測(cè)骨鈣素(osteocalcin,OC)濃度。
　　 6.在第21天時(shí),進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色,然后在Olympus顯微鏡(IX71

6、型,日本)下進(jìn)行組織學(xué)觀察,并統(tǒng)計(jì)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.制作的DBM顏色淡黃,質(zhì)地較軟。掃描電鏡下可見(jiàn)DBM孔隙表面較光滑,孔隙大小為115.4μm-188.4μm,平均孔徑為140.85±21.75μm。能譜儀檢測(cè)DBM鈣含量為11.49±0.84％。
　　 2.分離的原代hMSCs呈圓形,24h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁,呈梭形生長(zhǎng);當(dāng)hMSCs生長(zhǎng)達(dá)80％融合后,呈同向性生長(zhǎng),旋渦狀排列,細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)而有突

7、起。hMSCs的表面抗原CD44、CD105免疫組化染色陽(yáng)性,細(xì)胞膜呈棕褐色。
　　 3.根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果,CD組、CP組和CDP組生長(zhǎng)曲線較C組前移,CDP組較C組、CD組、CP組有更高的增殖峰值(p＜0.01);在第7、10、14天時(shí),CDP組較C組、CD組、CP組升高(P＜0.01),在第7、10天時(shí),CD組較CP組升高(P＜0.01)。
　　 4.種植后1天,各組間ALP活性無(wú)明顯差異。在種植7天后CD組、CP

8、組、CDP組ALP活性均明顯升高(p＜0.01),隨即CP組開(kāi)始持續(xù)下降,而14天時(shí)CD組和CDP組ALP活性才達(dá)到最高值。第7、14天時(shí)CDP組ALP活性均較CD組、CP組顯著升高(p＜0.01),第14天時(shí)CD組ALP活性較CP組顯著升高(p＜0.01)。在21天時(shí)CD組、CP組、CDP組組間ALP活性無(wú)顯著性差異,但以上三組仍較C組顯著升高(p＜0.011。
　　 5.除C組外,CD組、CP組和CDP組的OC值在種植7天后

9、均持續(xù)顯著增高(p＜0.01),其中CDP組增速最快,CD組和CP組OC值在前14天培養(yǎng)過(guò)程中均無(wú)顯著性差異,第21天時(shí)CD組較CP組顯著升高。CDP組OC值在7、14、21天時(shí)均較CD組、CP組顯著升高(p＜0.01)。
　　 6.在21天時(shí)鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色在40倍鏡下觀察,平均視野內(nèi)形成的鈣結(jié)節(jié)數(shù)目為C組0個(gè),CD組13.50±1.93個(gè),CP組9.88±1.55個(gè),CDP組19.13±3.27,鈣結(jié)節(jié)數(shù)量CDP組明顯要多于

10、另外三組(p＜0.01),CD組多于CP組(p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.DBM與PEMF聯(lián)合刺激及DBM和PEMF單獨(dú)刺激均加快hMSCs的增殖;DBM促hMSCs增殖能力強(qiáng)于PEMF;DBM與PEMF聯(lián)合刺激hMSCs增殖較。DBM和PEMF單獨(dú)刺激更強(qiáng)。
　　 2.DBM和PEMF單獨(dú)刺激促進(jìn)hMSCs成骨分化的時(shí)間過(guò)程基本一致,但DBM的促分化作用更強(qiáng);DBM與PEMF聯(lián)合對(duì)hMSCs的促分化