脈沖電磁場(chǎng)環(huán)境對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化影響的研究.pdf

1、目的:
　　 1、從人體脂肪組織中分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(humanadiposemesenchymalstemcells，hADSCs)，并鑒定其基本生物學(xué)特性，為后續(xù)研究提供種子細(xì)胞。
　　 2、通過(guò)檢測(cè)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中特異性基因的表達(dá)，探討脈沖電磁場(chǎng)環(huán)境對(duì)hADSCs成骨分化的影響。
　　 方法:
　　 1、經(jīng)知情同意后，運(yùn)用Ⅱ型膠原酶消化法結(jié)合細(xì)胞貼壁法從成人吸脂手術(shù)中獲取的脂

2、肪組織中分離出人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)的觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第2代hADSCs細(xì)胞表面標(biāo)志;取第3代hADSCs分別進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，采用組織化學(xué)染色、免疫化學(xué)染色進(jìn)行鑒定。
　　 2、取第3代hADSCs分別培養(yǎng)在A組:脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，B組:成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，C組:脈沖電磁場(chǎng)環(huán)境+脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，D組:脈沖電磁場(chǎng)環(huán)境+成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基;檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶活性，組織化

3、學(xué)染色觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成，Real-timePCR檢測(cè)Runx2、BMP2、Co-Ⅰ基因表達(dá)量，Westernblot檢測(cè)Runx2、BMP2、Co-Ⅰ蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.所分離培養(yǎng)出的細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，原代培養(yǎng)的細(xì)胞24h開始貼壁;P1、P3、P6代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線整體均呈“S”形，P2代人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD105呈陽(yáng)性，而CD34、CD45呈陰性;經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后鏡

4、下可見鈣結(jié)節(jié)形成，VonKossa銀染色呈陽(yáng)性;經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化后細(xì)胞內(nèi)可見大量脂滴形成，油紅O染色呈陽(yáng)性，經(jīng)軟骨誘導(dǎo)分化后，部分細(xì)胞聚集成軟骨細(xì)胞特有的鋪路石樣改變，甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽(yáng)性，對(duì)照組均為陰性。
　　 2.B、C、D三組細(xì)胞形態(tài)呈成骨細(xì)胞形態(tài)，鈣結(jié)節(jié)染色呈陽(yáng)性，A組無(wú)變化;在ALP活性、Runx2、BMP2、Co-Ⅰ基因表達(dá)量及蛋白表達(dá)水平方面，B、C、D三組顯著高于A組(P＜0.05)，D組顯著高