脈沖電磁場環(huán)境對人脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化影響的研究.pdf

1、目的:
　　 1、從人體脂肪組織中分離培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細胞(humanadiposemesenchymalstemcells，hADSCs)，并鑒定其基本生物學特性，為后續(xù)研究提供種子細胞。
　　 2、通過檢測人脂肪間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中特異性基因的表達，探討脈沖電磁場環(huán)境對hADSCs成骨分化的影響。
　　 方法:
　　 1、經(jīng)知情同意后，運用Ⅱ型膠原酶消化法結(jié)合細胞貼壁法從成人吸脂手術(shù)中獲取的脂

2、肪組織中分離出人脂肪間充質(zhì)干細胞，對其進行細胞生長和形態(tài)學的觀察，流式細胞儀檢測第2代hADSCs細胞表面標志;取第3代hADSCs分別進行成脂、成骨、成軟骨誘導，同時設立陰性對照組，采用組織化學染色、免疫化學染色進行鑒定。
　　 2、取第3代hADSCs分別培養(yǎng)在A組:脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，B組:成骨誘導培養(yǎng)基，C組:脈沖電磁場環(huán)境+脂肪間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基，D組:脈沖電磁場環(huán)境+成骨誘導培養(yǎng)基;檢測細胞堿性磷酸酶活性，組織化

3、學染色觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成，Real-timePCR檢測Runx2、BMP2、Co-Ⅰ基因表達量，Westernblot檢測Runx2、BMP2、Co-Ⅰ蛋白表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.所分離培養(yǎng)出的細胞形態(tài)呈長梭形，原代培養(yǎng)的細胞24h開始貼壁;P1、P3、P6代人脂肪間充質(zhì)干細胞的生長曲線整體均呈“S”形，P2代人脂肪間充質(zhì)干細胞表面標志CD29、CD105呈陽性，而CD34、CD45呈陰性;經(jīng)成骨誘導分化后鏡

4、下可見鈣結(jié)節(jié)形成，VonKossa銀染色呈陽性;經(jīng)成脂誘導分化后細胞內(nèi)可見大量脂滴形成，油紅O染色呈陽性，經(jīng)軟骨誘導分化后，部分細胞聚集成軟骨細胞特有的鋪路石樣改變，甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性，對照組均為陰性。
　　 2.B、C、D三組細胞形態(tài)呈成骨細胞形態(tài)，鈣結(jié)節(jié)染色呈陽性，A組無變化;在ALP活性、Runx2、BMP2、Co-Ⅰ基因表達量及蛋白表達水平方面，B、C、D三組顯著高于A組(P＜0.05)，D組顯著高