流體剪切力對不同鈦表面成骨細(xì)胞Wnt-β-catenin信號通路關(guān)鍵成員表達(dá)的影響.pdf

1、背景：種植義齒迄今已成為牙列缺損及牙列缺失修復(fù)方式的主要趨勢，其高成功率常見于報(bào)道，但仍不乏失敗案例。種植義齒的成敗取決于其是否達(dá)到良好的骨結(jié)合方式，成骨細(xì)胞的成骨作用與破骨細(xì)胞的骨吸收作用的動態(tài)平衡在骨性愈合中起到?jīng)Q定性作用，同時與其生物力學(xué)因素密切相關(guān)。骨性愈合的種植體受到負(fù)載后通過種植體將（牙合）力傳導(dǎo)到種植體-骨界面，如（牙合）力過大將導(dǎo)致種植體周圍骨的吸收、喪失，甚至種植體松動、脫落，最終造成種植失敗。因此，很多學(xué)者將研究的重

2、點(diǎn)集中到影響（牙合）力傳導(dǎo)的各個方面，如頜骨骨質(zhì)、種植體形態(tài)、上部結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)、（牙合）力和材料種類等，方法多采用二維、三維有限元分析以及光彈分析等。而直接針對種植界面的生物力學(xué)傳導(dǎo)及其生物學(xué)效應(yīng)的研究很少，對種植體細(xì)胞界面的細(xì)胞生物力學(xué)研究除本課題組的前期研究外則鮮有報(bào)道。骨的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中骨細(xì)胞執(zhí)行著力學(xué)傳感和力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。當(dāng)骨或者植入種植體負(fù)載時，細(xì)胞周圍的未礦化基質(zhì)產(chǎn)生擠壓，從而在骨細(xì)胞胞膜表面產(chǎn)生流體剪切力。Klei-Nu

3、lend等證實(shí)骨細(xì)胞受到流體流動的作用而被激活。也有研究證明成骨細(xì)胞在流體力的作用下也可產(chǎn)生類似反應(yīng)。種植體-骨界面細(xì)胞在流體剪切力的作用下必然發(fā)生從形態(tài)到功能轉(zhuǎn)變的生物學(xué)反應(yīng)，其過程伴隨著一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而其中哪些信號分子扮演著何種角色尚不完全清楚。由于Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤細(xì)胞的生長增殖關(guān)系密切，過往研究一般將其作為腫瘤治療研究的靶點(diǎn)，而近年來發(fā)現(xiàn)此通路中的一個跨膜共受體分子——低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(Lrp5

4、)基因突變可導(dǎo)致骨相關(guān)疾病。Lrp5功能缺失突變可致骨組織成骨細(xì)胞數(shù)目減少，對力學(xué)加載的響應(yīng)下調(diào)，骨密度下降;其功能獲得性突變則使成骨細(xì)胞數(shù)目增加，組織對力學(xué)加載的響應(yīng)更敏感，骨密度增高。除此因子，通路中其余相關(guān)分子，如Wnt蛋白、Lrp6、DKK1、β-catenin等基因突變均可導(dǎo)致不同程度的骨代謝異常。因此Wnt/β-catenin信號通路逐漸成為與骨組織相關(guān)的細(xì)胞生物力學(xué)研究的熱點(diǎn)。但由于各實(shí)驗(yàn)組采用不同的實(shí)驗(yàn)條件，對于Wnt/

5、β-catenin信號通路在骨形成過程中的作用尚無統(tǒng)一認(rèn)識。本研究分為三個部分：
　　 第一章：流體剪切力對不同鈦表面原代成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵成員mRNA表達(dá)的影響。
　　 目的：旨在模擬體內(nèi)環(huán)境建立種植體細(xì)胞界面應(yīng)力作用體外模型，觀察流體剪切力及表面微形貌對種植體細(xì)胞界面原代成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路的影響。
　　 方法：⑴取新生一天SD大鼠顱骨，采用二次酶消化連續(xù)組織

6、塊培養(yǎng)法作原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)。原代成骨細(xì)胞鑒定:堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色。⑵采用不同方法制備拋光處理純鈦鈦片（P組）、噴砂酸堿處理純鈦鈦片（S組）。表面形貌定性檢測:掃描電鏡(SEM)觀測表面微形貌。⑶將大鼠原代成骨細(xì)胞分別接種于玻片（G組）、P組鈦片、S組鈦片表面，培養(yǎng)72小時后，實(shí)驗(yàn)組置于流體加載系統(tǒng)中，施加12dynes/cm2流體剪切力，分別作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h;對照組在2％血清的培養(yǎng)液中靜置

7、0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h。⑷處理后提取細(xì)胞RNA，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測Lrp5和β-cateninmRNA的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)方法能在較短時間內(nèi)獲得較多原代成骨細(xì)胞，所得大鼠原代成骨細(xì)胞生長良好，堿性磷酸酶染色呈藍(lán)紫色，并可見部分深染顆粒;培養(yǎng)4周形成多個肉眼可見白色的礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色呈鮮紅色，符合成骨細(xì)胞生物學(xué)特征。②純鈦鈦片表面處理后呈現(xiàn)不同表面形貌。P組表面為方向一致的劃痕。

8、S組呈現(xiàn)微米級、納米級多級孔洞結(jié)構(gòu)。③經(jīng)析因分析，表面處理因素、流體剪切力力學(xué)因素及時間因素三因素對細(xì)胞Lrp5和β-catenin mRNA表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均小于0.001）。提示細(xì)胞Lrp5和β-catenin mRNA的表達(dá)有表面依賴性、力學(xué)刺激依賴性及加載時間依賴性。實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)量明顯高于對照組，S表面基因表達(dá)量明顯高于G、P兩表面。兩目標(biāo)因子mRNA水平在流體剪切力作用下均在0.5-1h內(nèi)達(dá)到峰值。受力情況下兩

9、種鈦表面Lrp5 mRNA均在0.5h達(dá)高峰，G組Lrp5 mRNA在1h達(dá)高峰，而β-catenin mRNA在三種表面的高峰均出現(xiàn)在0.5h。在S組表面，Lrp5和β-catenin mRNA均呈驟升后下落再緩升的趨勢。說明流體剪切力和噴砂酸堿處理鈦表面均能促進(jìn)原代成骨細(xì)胞Lrp5和β-catenin mRNA的表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)水平峰值出現(xiàn)在加力時間早期。
　　 第二章：流體剪切力對不同鈦表面MG63細(xì)胞Wnt/β-ca

10、tenin信號通路關(guān)鍵成員mRNA表達(dá)的影響。
　　 目的：通過檢測不同成骨樣細(xì)胞對相同處理的反應(yīng)與原代成骨細(xì)胞進(jìn)行對比，進(jìn)一步探討Wnt/β-catenin信號通路在成骨細(xì)胞發(fā)揮功能過程中的作用。
　　 方法：⑴采用不同方法制備拋光處理純鈦鈦片（P組）、噴砂酸堿處理純鈦鈦片(S組)。⑵將MG63細(xì)胞復(fù)蘇傳代培養(yǎng)，分別接種于玻片（G組）、P組鈦片、S組鈦片表面，培養(yǎng)72小時后，實(shí)驗(yàn)組置于流體加載系統(tǒng)中，施加12dynes

11、/cm2流體剪切力，分別作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h;對照組在2％血清的培養(yǎng)液中靜置0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h。⑶處理后提取細(xì)胞RNA，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測Lrp5和β-cateninmRNA的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：①從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，力學(xué)因素并不能顯著引起MG63細(xì)胞Lrp5 mRNA表達(dá)的變化，而其P值處于臨界值，若能增大樣本量，可能會出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;不同表面可引起Lrp5 mRN

12、A表達(dá)的不同，其中噴砂酸堿處理表面在本實(shí)驗(yàn)時間段內(nèi)(0-4h)靜止的情況下下調(diào)了Lrp5 mRNA的表達(dá)水平，而受力的情況下三表面無明顯差異;而從時間趨勢上分析，受力情況下，玻片表面Lrp5 mRNA呈現(xiàn)雙峰，光滑鈦表面及噴砂酸堿處理表面Lrp5 mRNA呈隨時間推移逐漸上調(diào)的趨勢，呈線性相關(guān)，推測在持續(xù)受力4h以后，兩種鈦表面Lrp5 mRNA表達(dá)可能繼續(xù)上調(diào)。②對于β-catenin，力學(xué)因素則能引起其mRNA表達(dá)的變化，表現(xiàn)為12

13、dynes/cm2的FSS能夠上調(diào)β-catenin mRNA水平;表面因素卻對其無明顯影響;從時間趨勢上分析，與Lrp5相似，受力情況下，玻片表面β-cateninmRNA呈現(xiàn)雙峰，光滑鈦表面及噴砂酸堿處理表面β-catenin mRNA呈隨時間推移逐漸上調(diào)的趨勢，呈線性相關(guān)，推測在持續(xù)受力4h以后，兩種鈦表面β-catenin mRNA表達(dá)可能繼續(xù)上調(diào)。③結(jié)合Lrp5與β-catenin的結(jié)果分析，F(xiàn)SS能促進(jìn)MG63細(xì)胞β-cat

14、enin mRNA水平上調(diào)，而對Lrp5 mRNA卻無明顯影響;不同表面對Lrp5mRNA影響不同，噴砂酸堿處理鈦表面使M663細(xì)胞Lrp5 mRNA水平下調(diào)，而表面因素對β-catenin mRNA水平卻無明顯影響;兩目標(biāo)因子mRNA均表現(xiàn)出隨受力時間的不同而變化，其中玻片表面mRNA表達(dá)水平均在0.5h、2h呈雙峰，光滑鈦表面及噴砂酸堿處理鈦表面mRNA表達(dá)水平均呈隨受力時間延長而上調(diào)。
　　 第三章：流體剪切力對不同鈦表面

15、MG63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵成員蛋白表達(dá)的影響。
　　 目的：通過檢測MG63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)成員蛋白水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討流體剪切力及鈦表面對此通路的影響。
　　 方法：⑴采用不同方法制備拋光處理純鈦鈦片（P組）、噴砂酸堿處理純鈦鈦片(S組)。⑵將MG63細(xì)胞分別接種于玻片（G組）、P組鈦片、S組鈦片表面，培養(yǎng)72小時后，實(shí)驗(yàn)組置于流體加載系統(tǒng)中，施加12dynes/

16、cm2流體剪切力，分別作用0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h;對照組在2％血清的培養(yǎng)液中靜置0h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h。⑶處理后消化收集細(xì)胞進(jìn)行胞漿蛋白及核蛋白分離提取，分別用來進(jìn)行Lrp5和β-catenin的Western blot檢測。
　　 結(jié)果：①靜止組Lrp5蛋白表達(dá)水平比受力組高，表明12 dynes/cm2的FSS抑制了MG63細(xì)胞Lrp5蛋白的表達(dá)。兩種鈦表面的蛋白表達(dá)水平均比玻片表

17、面要低，但粗糙鈦表面與光滑鈦表面之間無顯著差異，表明此條件下鈦表面可能抑制了Lrp5蛋白的表達(dá)，粗糙表面的性質(zhì)未必能影響Lrp5蛋白的表達(dá)。受力和靜止的情況下，Lrp5蛋白的表達(dá)均隨時間變化而有差異，且在FSS作用下，其表達(dá)水平與時間呈線性相關(guān)，G組和P組水平均隨時間遷移而下調(diào)，S組則隨時間遷移而上調(diào)。②β-catenin蛋白的表達(dá)有力學(xué)因素、表面因素依賴性，不同時間點(diǎn)在受力情況下有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。受力組蛋白表達(dá)水平比靜止組

18、高，說明12dynes/cm2的FSS促進(jìn)了MG63細(xì)胞β-catenin蛋白在核內(nèi)的表達(dá)。靜止情況下G組表達(dá)水平最低，S組與P組無顯著差異，而受力情況下S組水平最高，P組水平最低，說明不同表面可影響β-catenin蛋白在核內(nèi)的表達(dá)，粗糙表面能促進(jìn)FSS作用下β-catenin蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。相關(guān)性分析顯示β-catenin蛋白水平與時間并無線性相關(guān)，三種表面蛋白表達(dá)水平均在早期出現(xiàn)高峰。③結(jié)合Lrp5和β-catenin結(jié)果分析，1

19、2 dynes/cm2的FSS促進(jìn)β-catenin蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，同時抑制了胞質(zhì)Lrp5蛋白的表達(dá);鈦表面可能抑制了Lrp5蛋白的表達(dá)，粗糙表面的性質(zhì)未必能影響Lrp5蛋白的表達(dá)，在受力情況下能促進(jìn)β-catenin蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn);兩種蛋白的表達(dá)均隨受力時間的長短而變化。
　　 結(jié)論：大鼠原代成骨細(xì)胞與人成骨肉瘤細(xì)胞MG63對力學(xué)、表面因素的響應(yīng)不同，其在生物分子水平的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化也表現(xiàn)出明顯差異。適宜大小的FSS以及噴砂酸堿

20、處理鈦表面均能促進(jìn)原代成骨細(xì)胞Lrp5及β-catenin的基因轉(zhuǎn)錄，從而可能上調(diào)了Wnt/β-catenin信號通路，并且噴砂酸堿處理鈦表面可能提高了原代成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路對FSS刺激的敏感性。而在MG63細(xì)胞中， FSS可能未經(jīng)Wnt/Lrp5信號途徑激活β-catenin下游信號通路，而隨受力時間的延長，不同表面的信號通路可能再次發(fā)生不同的轉(zhuǎn)變，Lrp5 mRNA和蛋白水平在噴砂酸堿處理表面的下調(diào)，推測此表