冠心病患者microRNA-155調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)論述:
　　第一部分 冠心病患者microRNA-155與Th細(xì)胞分化的相關(guān)性
　　目的:觀察CHD患者外周血中炎癥相關(guān)的miRNAs的表達(dá)情況和Th細(xì)胞亞群的分化情況，并分析二者之間的關(guān)系。
　　方法:收集穩(wěn)定型心絞痛（stable angina, SA）患者、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina, UA）患者、AMI患者及性別、年齡與其無(wú)差異的胸痛綜合征（chest pain s

2、yndrome, CPS）患者各15-16例。分別采集每位患者外周血8mL，離心收集血漿，密度梯度法離心獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）。用Trizol LS和Trizol試劑分別提取外周血血漿及PBMCs中的RNA，再用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription and quantitative real-time polymer

3、ase chain reaction, qRT-PCR）的方法檢測(cè)炎癥相關(guān)的miRNAs的表達(dá)情況；用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)患者外周血PBMCs中Th細(xì)胞亞群的比例；用熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization, FISH）及免疫組化的方法分別顯示PBMCs中miR-155和Th17細(xì)胞的分布情況。
　　結(jié)果:與CPS患者PBMCs中相應(yīng)miRNAs的表達(dá)水平相比，UA和AMI患者PBMCs中m

4、iR-21和miR-146a的表達(dá)水平均升高約2倍（p<0.01），miR-155的表達(dá)水平則降低約50％（p<0.01），而miR-125a-5p、miR-125b和miR-31的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（p>0.05）。除了miR-21，上述其他miRNAs在UA及AMI患者血漿中的表達(dá)情況與它們?cè)赑BMCs中的表達(dá)情況基本一致（p>0.05）。但與CPS患者血漿中 miR-21的表達(dá)量相比，AMI患者血漿中其表達(dá)量升高約6倍（p<0.0

5、1），而UA患者血漿中其表達(dá)量無(wú)明顯變化（p>0.05）。然而，SA患者外周血中上述miRNAs的表達(dá)水平與CPS患者相比無(wú)明顯差異（p>0.05）。進(jìn)一步分析了CHD患者PBMCs中各個(gè)Th細(xì)胞亞群的比例。結(jié)果顯示，與CPS患者相比，UA和AMI患者PBMCs中Th1和Th17細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例明顯升高（p<0.01），Treg細(xì)胞的比例明顯降低（p<0.01），而Th2細(xì)胞的比例則無(wú)明顯變化（p>0.05）。進(jìn)一步，用Sp

6、earman’s相關(guān)性分析法分析發(fā)現(xiàn)，ACS患者（包括UA及AMI患者）PBMCs中miR-155的表達(dá)與Th17細(xì)胞的比例呈高度負(fù)相關(guān)（r=-0.896, p<0.01）。深入研究還發(fā)現(xiàn)，miR-155和IL-17A可共表達(dá)于UA及AMI患者PBMCs中相同細(xì)胞內(nèi)。
　　結(jié)論:部分炎癥相關(guān)的miRNAs在ACS患者外周血中呈特異性表達(dá)，且miR-155的表達(dá)水平與Th細(xì)胞的分化密切相關(guān)。
　　第二部分 MicroRNA-1

7、55誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化的作用機(jī)制
　　目的:明確miR-155如何調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞亞群（包括Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞）的分化及其特異性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，并明確miR-155主要作用的靶基因及其主要調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。
　　方法:取BALB/c小鼠脾臟，研磨并密度梯度法離心獲取脾臟單個(gè)核細(xì)胞；磁珠分選獲得高純度CD4+T細(xì)胞（純度>95％）；用nucleofection的方法將寡聚核苷酸（包括pre-m

8、iR-ctrl、pre-miR-155、anti-miR-ctrl、anti-miR-155、SOCS1-TPmiR-155和control-TPmiR-155）轉(zhuǎn)入CD4+T細(xì)胞；用特異性抗體活化并極化CD4+T細(xì)胞；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞亞群的比例；用qRT-PCR的方法檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況；用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)相關(guān)細(xì)

9、胞因子的表達(dá)情況；用免疫印跡分析（Western boltting）檢測(cè)靶基因及相關(guān)信號(hào)通路中重要蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:當(dāng)miR-155過(guò)表達(dá)時(shí)，Th17及Treg細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例及其標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子孤獨(dú)受體（retinoic acidrelated orphan receptorγt, ROR-γt）和叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Fork head/winged helix transcription facto

10、r, Foxp3）的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（p<0.05）。反之，當(dāng)miR-155的表達(dá)被抑制時(shí)，Th17及Treg細(xì)胞的比例及其標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)則明顯低于對(duì)照組（p<0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-155過(guò)表達(dá)時(shí)，Th17細(xì)胞的功能性細(xì)胞因子白介素-17A（interleukin17A, IL-17A）的表達(dá)也明顯升高（p<0.05），而miR-155被抑制后，其表達(dá)則明顯降低（p<0.05）。然而，miR-155對(duì)Treg的功能性細(xì)

11、胞因子IL-10及腫瘤生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）的表達(dá)無(wú)明顯調(diào)控作用（p>0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶-信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinas/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT）信號(hào)通路的負(fù)反饋抑制因子，即細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cyt

12、okine-signaling-1, SOCS1）是miR-155的重要靶基因。在CD4+T細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-155通過(guò)抑制SOCS1的表達(dá)而間接激活JAK/STAT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)Th17及Treg細(xì)胞的分化，并影響Th17的功能。研究還證實(shí)，當(dāng)miR-155過(guò)表達(dá)時(shí)，Th1的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和功能性細(xì)胞因子，即T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（T-box expressed in T cells, T-bet）和干擾素-γ（interferon

13、-γ, IFN-γ）的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而Th2的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和功能性細(xì)胞因子，即GATA結(jié)合蛋白（GATA-binding protein-3, GATA3）和IL-4的表達(dá)則明顯低于對(duì)照組（p<0.05）；而當(dāng)miR-155被抑制后，Th1和Th2的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)與上述情況恰好相反（p<0.05）。
　　結(jié)論:MiR-155可促進(jìn)促炎性CD4+T細(xì)胞亞群Th1及Th17細(xì)胞的分化及其功能的發(fā)揮；抑制抑炎性C

14、D4+T細(xì)胞亞群Th2細(xì)胞的分化及其功能的發(fā)揮；而對(duì)Treg細(xì)胞，miR-155可促進(jìn)其分化，但并不影響其功能的發(fā)揮。而且miR-155主要通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路的負(fù)反饋抑制因子SOCS1的表達(dá)而調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞的分化?？傊?，miR-155可通過(guò)抑制SOCS1的表達(dá)而誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化的失衡。
　　第三部分 MicroRNA-155誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向DC細(xì)胞分化
　　目的:明確miR-155如

15、何調(diào)控RAW264.7細(xì)胞表面分子及細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　方法:培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，用Attractene Transfection Reagent將寡聚核苷酸（包括pre-miR-ctrl、pre-miR-155、anti-miR-ctrl及anti-miR-155）轉(zhuǎn)入RAW264.7細(xì)胞；用不同濃度的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS）和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density

16、lipoprotein, oxLDL）刺激細(xì)胞；用qRT-PCR的方法檢測(cè)miR-155的表達(dá)量；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)記物的表達(dá)量；用qRT-PCR及ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá)量。
　　結(jié)果:用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24hrs后，miR-155的表達(dá)量比對(duì)照組升高約200倍（p<0.01），而用oxLDL刺激細(xì)胞24hrs后，其表達(dá)量?jī)H升高約2倍（p<0.05）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在LPS或oxLDL活化的RAW2

17、64.7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-155后，其表面分子人類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體-I（Major histocompatibility complex-I, MHC-I）、MHC-II、CD86及CD83及細(xì)胞因子IL-6、IL-12及IL-1b的表達(dá)均升高（p<0.05），相反，當(dāng)miR-155的表達(dá)被抑制時(shí)，上述表面分子和細(xì)胞因子的表達(dá)則降低（p<0.05）。此外，在oxLDL活化的RAW264.7細(xì)胞中，miR-155誘導(dǎo)表達(dá)的表面分子還