冠心病患者血漿microRNA表達譜的篩選及其臨床意義研究.pdf

1、目的:
　　冠心?。–AD）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而早期診斷和治療冠心病能有效降低其死亡率；但目前尚無理想的診斷冠心病的生物標(biāo)志物，因此發(fā)展一種新的、有更高的敏感性和特異性的生物標(biāo)志物具有重要意義。MicroRNA（miRNA）是一類長度為19~24個核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性小單鏈 RNA分子，且在心血管系統(tǒng)高度表達，幾乎參與調(diào)控了心臟所有的病理生理過程，在心臟的正常發(fā)育、冠狀動脈粥樣硬化、心肌

2、細(xì)胞損傷等過程中均發(fā)揮著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)血漿中 miRNA能穩(wěn)定存在，且隨疾病發(fā)生發(fā)展而表達水平發(fā)生改變；因此，血漿 miRNA檢測可能成為冠心病診斷和治療的理想生物標(biāo)志物；而目前這方面的研究尚很少。
　　本研究的目的是篩選出冠心病患者血漿中與正常人血漿相比存在顯著差異的miRNAs；同時進一步研究上游轉(zhuǎn)錄因子對 miRNA(s)的調(diào)控作用,為 miRNA(s)在冠心病發(fā)病機制中的調(diào)控作用提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:<

3、br>　　選擇2012年9月至2013年10月在寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心血管內(nèi)科就診患者，冠心病組為通過冠狀動脈造影診斷至少有一條或一條以上的主干冠狀動脈狹窄大于50％或以上的患者;正常對照組為通過冠狀動脈造影診斷冠狀動脈未見狹窄或僅有心肌橋病變的患者。運用miRNA基因芯片技術(shù)初步篩選冠心病病人和正常健康者血漿中的miRNA表達譜，每組各3例樣本，然后通過對基因芯片結(jié)果進行聚類分析，并對冠心病組中表達顯著升高且差異倍數(shù)>5倍的miR

4、NAs進一步采用qRT-PCR技術(shù)進行擴大樣本量(冠心病組:120例,正常對照組120例)驗證，以尋找在冠心病中有顯著差異表達的miRNAs。同時,通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測與冠心病相關(guān)miRNA(s)基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;然后進一步應(yīng)用雙螢光素酶實驗進行驗證其可靠性。
　　結(jié)果:
　　miRNA基因芯片初篩結(jié)果顯示,與正常組相比,有4個miRNAs（miR-206、miR-302a-3p、miR-383、miR-574

5、-5p）在冠心病組中表達顯著升高（P值均<0.01)且表達倍數(shù)均大于5倍。進一步運用 qRT-PCR技術(shù)擴大樣本量進行驗證結(jié)果顯示，miR-206和miR-574-5p在冠心病組中的表達水平與正常組相比仍存在顯著差異(P值均<0.01);且ROC曲線表明這兩個miRNAs對冠心病的診斷均有較好的敏感性和特異性。同時,生物信息學(xué)軟件預(yù)測 hsa-miR-206啟動子區(qū)有2個轉(zhuǎn)錄因子 MyoD結(jié)合位點;進一步雙螢光素酶報告基因測定系統(tǒng)證實M