體外調節(jié)GJIC對兔成骨細胞成脂分化的影響.pdf

1、目的:通過利用縫隙連接激動劑或縫隙連接阻滯劑調節(jié)成骨細胞間縫隙連接通訊(gapjunction intracellular communication，GJIC)，來研究GJIC對成骨細胞成脂分化的影響，為骨量減少性疾病如骨質疏松癥的治療提供新思路。
　　 方法:①提取出生一周內的新西蘭大白兔乳兔顱骨，采用酶消化—組織塊聯合培養(yǎng)法提取成骨細胞并傳代培養(yǎng)至第三代，每2～3天換液，每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。②取鋪滿培養(yǎng)板的第

2、三代成骨細胞，采用鈣化結節(jié)染色法（茜素紅染色法）進行成骨細胞的鑒定。③取第三代成骨細胞，常規(guī)消化后制備超薄切片，采用H-7500型透射電鏡觀察成骨細胞間縫隙連接超微結構。④取第三代成骨細胞在成脂誘導培養(yǎng)液中培養(yǎng)并誘導成脂分化，將成骨細胞分為三組:增強組加入終濃度為1μmol/L的縫隙連接激動劑前列腺素E2(PGE2);抑制組加入終濃度為50μmol/L的縫隙連接阻滯劑18α-甘草次酸(18α-GA);設置空白對照組。倒置顯微鏡下每天觀察

3、細胞形態(tài)變化。⑤噻唑藍(MTT)比色法測定1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA對成骨細胞的增殖有無毒性作用。⑥三組細胞成脂誘導兩周后，分別采用油紅O脂肪染色法鑒定各組細胞中脂肪組織的生成。⑦三組細胞成脂誘導兩周后，分別采用逆轉錄PCR(RT-PCR)技術檢測各組細胞中脂肪特異性標記物—過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的mRNA表達水平。⑧三組細胞成脂誘導兩周后，分別采用蛋白免疫印跡法(Western-blo

4、t)檢測各組細胞中Cx43蛋白表達水平。⑨將Cx43蛋白表達水平與PPARγmRNA表達水平進行線性相關分析。
　　 結果:①倒置顯微鏡下觀察，第3天左右觀察到成骨細胞從碎骨片周圍游出，原代成骨細胞貼壁生長，呈短梭形、三角形或多角形等不規(guī)則形態(tài)。第6天左右清除碎骨片，第9～12天成骨細胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底，即可進行傳代。傳代培養(yǎng)后，成骨細胞呈長梭形、鱗片形等形態(tài)，呈集落生長趨勢。②取第三代成骨細胞進行茜素紅染色，結果顯示成骨細胞

5、聚集處有大量被染成橘紅色的鈣化結節(jié)出現，證明提取的細胞為成骨細胞。③透射電鏡觀察成骨細胞間縫隙連接，可以觀察到成骨細胞縫隙連接結構:每個縫隙連接由6個亞單位組成，位于相鄰細胞的細胞間隙和細胞質之間，以利于細胞間的信號轉導。④MTT比色法結果顯示，實驗組細胞經過1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA處理24h后測490nm下吸光度（A值）顯示增強組、抑制組、對照組三組A值分別為0.221±0.007，0.228±0.01

6、1，0.219±0.012，三組之間兩兩相比較P值均大于0.05，差異無統計學意義，證明1μmol/L的PGE2和50μmol/L的18α-GA對成骨細胞增殖均無毒性作用。⑤油紅O染色顯示，三組細胞成脂誘導兩周后，細胞形態(tài)由原來的長梭形、鱗片形逐漸變?yōu)闄E圓形，胞質中均有被紅染的脂滴出現，證實三組細胞均向脂肪細胞分化。⑥RT-PCR結果顯示，三組細胞成脂誘導兩周后，增強組、抑制組、對照組三組PPARγmRNA相對表達量分別為0.078±0

7、.022，1.106±0.085，0.425±0.041，增強組PPARγmRNA相對表達量分別與對照組和抑制組比較均明顯降低(P＜0.01)，差異具有統計學意義，抑制組PPARγmRNA與對照組比較表達明顯增高，(P＜0.01)，差異具有統計學意義。⑦Western-blot結果顯示，三組細胞成脂誘導兩周后，增強組、抑制組、對照組三組細胞Cx43蛋白相對表達量分別為0.926±0.067，0.055±0.015，0.191±0.049

8、，增強組Cx43蛋白相對表達量分別與對照組和抑制組比較明顯降低(P＜0.01)，差異具有統計學意義，抑制組Cx43蛋白與對照組比較表達明顯增高(P＜0.01)，差異具有統計學意義。⑧線性相關分析顯示，PPARγmRNA表達水平與Cx43蛋白表達水平呈負相關關系，r=-0.8356，差異具有統計學意義。
　　 結論:1.成骨細胞在成脂誘導環(huán)境下可以向脂肪細胞分化。2.在成骨細胞成脂分化中，增強成骨細胞間GJIC可以抑制成骨細胞成脂