MAPK信號通路對肝癌多藥耐藥的影響研究.pdf

1、目的：
　　 1．化療藥物誘導(dǎo)建立多株人肝癌多藥耐藥模型，鑒定其耐藥性，比較親本株與耐藥株生物學(xué)特點(diǎn)的差異。
　　 2．檢測人肝癌細(xì)胞親本株及耐藥株中SP細(xì)胞比例，探索耐藥細(xì)胞與SP細(xì)胞的聯(lián)系。
　　 3．檢測人肝癌多藥耐藥細(xì)胞模型中MAPK表達(dá)情況，探索人肝癌細(xì)胞株中MAPK信號通路與多藥耐藥的關(guān)系。
　　 4．檢測人肝癌組織中MAPK與MDR1表達(dá)情況，探索人肝癌組織MAPK信號通路與多藥耐藥的關(guān)系，

2、以及MAPK在肝癌組織中的表達(dá)情況。
　　 方法：
　　 1．采用ADM對HepG2、SMMC-7721、BEL-7402等三株人肝癌細(xì)胞株進(jìn)行大劑量沖擊和小劑量緩升兩種方法誘導(dǎo)。采用生物發(fā)光法及MTT法進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)并計(jì)算耐藥指數(shù)，免疫組化、RT-PCR檢測耐藥基因及相關(guān)蛋白表達(dá)。免疫組化法檢測細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡，Transwell檢測細(xì)胞體外侵襲能力，比較耐藥株與親本株的差異。
　　

3、 2．熒光顯微鏡計(jì)數(shù)淡染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析、分選SP細(xì)胞，無血清培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長特性，侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SP細(xì)胞在侵襲、遷移方面的能力。
　　 3.RT-PCR和WesternBlot檢測MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中ERK1、ERK2、ERK5、JNK1、JNK2、P38α等基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。
　　 4．制作組織芯片，免疫組化檢測MDR1蛋白表達(dá)水平，石蠟包埋組織中提取RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測MAPK細(xì)胞信號通路基因表達(dá)

4、水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．誘導(dǎo)得到六株細(xì)胞系。與親本株相比，耐藥株耐藥指數(shù)均大于5，對多種化療藥耐受性增強(qiáng)，耐藥基因、耐藥蛋白表達(dá)上調(diào)2～10倍，并以高濃度沖擊法誘導(dǎo)的細(xì)胞上調(diào)更顯著。耐藥細(xì)胞增殖活性升高20倍以上，細(xì)胞周期S期阻滯，體外侵襲能力增強(qiáng)1.3～2.5倍，ADM干預(yù)后，凋亡率減少50％以上。
　　 2．人肝癌細(xì)胞親本株SP細(xì)胞比例最低，低濃度緩升誘導(dǎo)組SP細(xì)胞比例最高，高濃度沖擊誘導(dǎo)組SP細(xì)胞比

5、例居于兩者之間。
　　 3．人肝癌耐藥細(xì)胞株MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中不同基因和蛋白表達(dá)量均有不同比例升高，ERK1、ERK2升高明顯。
　　 4．肝癌組織MDR1耐藥蛋白陽性率達(dá)85%以上，但MDR1含量與細(xì)胞分化程度無關(guān)。肝癌組織MAPK基因和MDR1蛋白表達(dá)水平高于癌旁組織。肝癌組織MAPK基因表達(dá)水平與MDR1蛋白表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)0.35～0.49，MAPK基因之間表達(dá)水平相關(guān)系數(shù)0.17～0.83;MAPK基因表達(dá)

6、水平與細(xì)胞分化程度不相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.ADM能夠誘導(dǎo)多株人肝癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性升高、細(xì)胞周期改變、抗凋亡能力及侵襲能力增強(qiáng)。
　　 2．耐藥細(xì)胞與SP細(xì)胞存在一定聯(lián)系，耐藥誘導(dǎo)可能可以起到富集SP細(xì)胞的作用。
　　 3．人肝癌多藥耐藥細(xì)胞模型中，MAPK激酶系統(tǒng)表達(dá)上調(diào)與多藥耐藥有一定關(guān)系。
　　 4．人肝癌組織MDR1耐藥蛋白表達(dá)水平明顯高于癌周組織，但MDR1