川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞ABC家族的抑制作用.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL-7402/ADM的建立
　　 一、人肝癌多藥耐藥細(xì)胞株BEL-7402/ADM的建立
　　 以文獻(xiàn)方法采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊誘導(dǎo)的模式，建立人肝癌BEL-7402/ADM 耐藥細(xì)胞株。
　　 二、MTT法測定人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL-7402/ADM的耐藥倍數(shù)
　　 取親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞，用0.25%胰酶消化處理對(duì)

2、數(shù)生長期細(xì)胞，用含8%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，每孔接種200μL，即2×104個(gè)∕mL，接種在96孔板上，設(shè)有空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、ADM組、5-FU組、VCR組和CDDP組，以上給藥組均設(shè)5個(gè)濃度。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選定490nm波長處測定OD值，參比波長為620nm。按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：生長抑制率=（1－給藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%.公式計(jì)算IC50值：lgIC50=Xm-I[P-

3、(3-Pm-Pn)/4]，Xm：lg 最大劑量；I：lg(最大劑量/相鄰劑量)；P：陽性反應(yīng)率之和；Pm：最大陽性反應(yīng)率；Pn：最小陽性反應(yīng)率。耐藥倍數(shù) (RI)=(IC Resistance group)/(IC Parental group)×100%.
　　 三、ADM不同誘導(dǎo)濃度對(duì)人肝癌細(xì)胞系BEL-7402中P-gp表達(dá)的影響
　　 以Western-blot法檢測在200、600﹑800﹑1000﹑2000

4、nmol/L不同ADM濃度誘導(dǎo)至穩(wěn)定增殖的肝癌BEL-7402細(xì)胞的P-gp的表達(dá)。結(jié)果以各組P-gp/α-tublin與未誘導(dǎo)的親本細(xì)胞（control組）的比值百分率（均值±標(biāo)準(zhǔn)差，X±SD）表示。
　　 四、細(xì)胞周期分析
　　 取對(duì)數(shù)生長期的BEL-7402、BEL-7402/ADM細(xì)胞于流式細(xì)胞儀測定DNA含量并進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
　　 五、流式細(xì)胞儀檢測親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積
　　 將

5、對(duì)數(shù)生長期的BEL-7402、BEL-7402/ADM細(xì)胞以8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ADM平均熒光強(qiáng)度。
　　 六、細(xì)胞貼壁率與平板克隆形成率的檢測
　　 收集BEL-7402親本細(xì)胞及BEL-7402/ADM多藥耐藥細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。以載玻片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)，各按每瓶1×106個(gè)分別接種于6個(gè)培養(yǎng)瓶內(nèi)。每間隔1h取1組細(xì)胞，吸棄未貼壁的細(xì)胞，消化貼壁細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

6、。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞貼壁率:細(xì)胞貼壁率=(貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。細(xì)胞平板克隆形成率參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方法。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊誘導(dǎo)的模式，成功建立了人肝癌BEL-7402/ADM 耐藥細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該細(xì)胞株雖然為ADM所誘導(dǎo)耐藥，但該耐藥株不僅對(duì)ADM產(chǎn)生了較高的耐藥性，對(duì)5－FU、VCR 及CDDP 亦有不同程度的耐藥性，證實(shí)了其類型為多藥耐藥。耐藥

7、細(xì)胞株經(jīng)凍存后復(fù)蘇并連續(xù)脫藥培養(yǎng)1個(gè)月后，其耐藥性可有所有下降，但通過短暫的藥物再次誘導(dǎo)，耐藥性仍能恢復(fù)至凍存之前的水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。
　　 2.從Western blot結(jié)果看，當(dāng)阿霉素誘導(dǎo)濃度在200 nmol/L時(shí)，對(duì)BEL－7402細(xì)胞P-gp的表達(dá)無影響。當(dāng)濃度在600 nmol/L以上時(shí)，P-gp表達(dá)顯著升高，但P-gp的表達(dá)量并不隨誘導(dǎo)劑量增加而顯著增加，而是耐藥表型隨著藥物的增加而逐漸穩(wěn)定。由于腫瘤多藥耐藥機(jī)

8、制非常復(fù)雜，可能存在多機(jī)制聯(lián)合作用導(dǎo)致耐藥，有待下一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　 3.有關(guān)腫瘤耐藥細(xì)胞周期與其親本細(xì)胞的區(qū)別，文獻(xiàn)報(bào)道不一。本研究中細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞存在一定差異。表現(xiàn)在耐藥細(xì)胞G0/G1比值減小，而G2/M、S期增加。各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果差異除了可能與實(shí)驗(yàn)條件不盡相同、誘導(dǎo)方法、操作誤差等都有關(guān)系。此外，耐藥的肝癌細(xì)胞在貼壁率、平板克隆形成率、細(xì)胞形態(tài)上與親本細(xì)胞還存在差異。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢

9、測結(jié)果，說明阿霉素誘導(dǎo)的多藥耐藥細(xì)胞耐藥的機(jī)制與外排藥物有關(guān)。結(jié)合Western blot結(jié)果，考慮可能P-gp參與了這一機(jī)制。
　　 第二部分：川芎嗪逆轉(zhuǎn)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM的作用及機(jī)制
　　 一、MTT法測定川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)
　　 將BEL-7402/ADM 以 TMP (400和 600 μmol/L)、VRP (5和 10μmol/L)分別

10、培養(yǎng)于96孔板至24 h，然后分別加入濃度為0.3，0.6，1.2，2.4，4.8 μmol/L的ADM 至 72 h。其中維拉帕米（Verapamil，VRP）為陽性對(duì)照。分別計(jì)算IC50 值、耐藥倍數(shù)、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。其中IC50值的計(jì)算按第一部分“MTT法測定人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL-7402/ADM的耐藥倍數(shù)”計(jì)算。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=(IC50 Resistance group)/(IC50 TMP/VRP group)×100%.

11、　　 二、熒光顯微鏡觀察川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM中ADM蓄積的影響
　　 將生長良好的BEL-7402/ADM及其親本細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，分為6組,陰性親本組、陰性耐藥組、親本組、耐藥組、TMP逆轉(zhuǎn)組、陽性對(duì)照組（VRP）。接種于培養(yǎng)瓶中，逆轉(zhuǎn)組加入川芎嗪至終濃度為600μmol/L，陽性對(duì)照組（VRP），加入VRP至終濃度為5μmol/L，逆轉(zhuǎn)組及陽性對(duì)照組在TMP或VRP中預(yù)培養(yǎng)3h，再與親本

12、組、耐藥組平行加入8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h，陰性親本組、陰性耐藥組加入新鮮培養(yǎng)液，不加任何藥物；各組以冰冷的PBS洗3次，熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞內(nèi)阿霉素的含量。激發(fā)光(λex)為480nm，發(fā)射光(λem)為575 nm。
　　 三、流式細(xì)胞儀檢測川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM中ADM蓄積的影響
　　 設(shè)陰性組、耐藥組、TMP組、VRP組。接種于培養(yǎng)瓶中，陰性對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)液，逆轉(zhuǎn)

13、組加入川芎嗪至終濃度為600μmol/L，陽性對(duì)照組（VRP），加入VRP至終濃度為5μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入ADM8000nmol/L，培養(yǎng)2h，以冰冷的PBS洗3次，胰酶消化為單個(gè)細(xì)胞懸液（不低于106個(gè)/mL）,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ADM平均熒光強(qiáng)度。激發(fā)光(λex)為480nm，發(fā)射光 (λem)為575nm.
　　 四、HPLC法檢測TMP對(duì)細(xì)胞內(nèi)ADM濃度的影響
　　 設(shè)親本組、耐藥組、TMP組、V

14、RP組。將TMP組、VRP組分別在TMP（600μmol/L）或VRP（5μmol/L中預(yù)培養(yǎng)3h，所有組再以8000 nmol/L ADM 培養(yǎng)2h，以HPLC檢測細(xì)胞內(nèi)ADM濃度。以目標(biāo)藥與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為橫坐標(biāo)，以藥物的濃度為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并考察重現(xiàn)性、精密度、加樣回收率、穩(wěn)定性等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以鹽酸阿霉素（分子量579.99）濃度單位折算為nmol/L。
　　 五、川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM

15、中MDR1、MRP2、MRP3、MRP5 mRNA表達(dá)的影響
　　 設(shè)耐藥組、TMP組、VRP組。將TMP組、VRP組分別在TMP（600μmol/L）或VRP（5μmol/L）中預(yù)培養(yǎng)3h，所有組再以8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h，采用PCR檢測MDR1，MRP2，MRP3和MRP5 mRNA表達(dá)水平。
　　 六、川芎嗪對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM中P-gp、MRP2、MRP3、MRP5蛋白表達(dá)

16、的影響
　　 細(xì)胞分設(shè)耐藥組、TMP組、VRP組。將TMP組、VRP組分別在TMP（600μmol/L）或VRP（5μmol/L）中預(yù)培養(yǎng)3h，所有組再以8000 nmol/L ADM培養(yǎng)2h，采用免疫印跡檢測P-gp、MRP2、MRP3、MRP5蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：
　　 1.川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP)自中藥川芎中分離，有研究表明其對(duì) HCC的耐藥有作用，可能與逆轉(zhuǎn)P－gp

17、有關(guān)，但仍然未見是否與逆轉(zhuǎn)其它蛋白有關(guān)。本研究探討了TMP對(duì)人肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM MDR的逆轉(zhuǎn)作用。研究發(fā)現(xiàn)：TMP可逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥細(xì)胞BEL-7402/ADM的MDR。
　　 2.TMP作用后，耐藥細(xì)胞內(nèi)的ADM蓄積增加，推測可能是由于TMP影響了ABC家族成員的一種或數(shù)種蛋白的表達(dá)及功能所致。
　　 3.Realtime PCR 及 Western blot結(jié)果證實(shí)，TMP作用于多藥耐藥細(xì)胞后

18、MDR1、MRP2、MRP3及MRP5在肝癌耐藥株細(xì)胞中mRNA及蛋白高表達(dá)可能發(fā)揮聯(lián)合耐藥作用，并可被TMP所抑制。
　　 4.研究還發(fā)現(xiàn)：TMP和第一代逆轉(zhuǎn)劑VRP均可以抑制MDR1，但川芎嗪對(duì)MRP2，MRP3，MRP5亦有效，不同于VRP；研究還發(fā)現(xiàn)：TMP和第一代逆轉(zhuǎn)劑VRP均可以抑制MDR1，但川芎嗪對(duì)MRP2，MRP3，MRP5亦有效，不同于VRP；TMP在使細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度蓄積增加的同時(shí)，川芎嗪本身在細(xì)胞內(nèi)的蓄積