葉酸修飾川芎嗪納米粒體內(nèi)外靶向特征及增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用研究.pdf

1、目的:
　　優(yōu)化葉酸殼聚糖川芎嗪納米粒(主動(dòng)靶向納米粒，F(xiàn)A-CS-LZ-NPs)的制備工藝，考察其體內(nèi)外靶向特征，探討其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用與機(jī)制。
　　方法:
　　1.主動(dòng)靶向納米粒制備和處方、工藝優(yōu)化。離子交聯(lián)法制備主動(dòng)靶向納米粒，選取葉酸殼聚糖(FA-CS)濃度、多聚磷酸鈉(TPP)濃度、pH值為主要影響因素，以包封率、載藥量、粒徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)納米粒處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2、　　2.主動(dòng)靶向納米粒體外靶向性考察。Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞葉酸受體表達(dá)水平，篩選細(xì)胞用于下一步試驗(yàn)。MTT法檢測(cè)主動(dòng)靶向納米粒的細(xì)胞毒性，確定給藥劑量。取Bel7402細(xì)胞（葉酸受體高表達(dá)）分別給予主動(dòng)靶向納米粒(FA-CS-LZ-NPs)、被動(dòng)納米粒(CS-LZ-NPs)和川芎嗪溶液(LZ)，另取L-02(葉酸受體低表達(dá))給予FA-CS-LZ-NPs，HPLC法檢測(cè)不同時(shí)間內(nèi)細(xì)胞對(duì)LZ的攝取。FA-CS-LZ-N

3、Ps作用于三種葉酸受體表達(dá)水平不同的細(xì)胞，4h后，HPLC法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)LZ的濃度。
　　3.主動(dòng)靶向納米粒體內(nèi)靶向性考察。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記FA-CS，紅外光譜、核磁共振光譜分析產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征。熒光素標(biāo)記主動(dòng)納米粒(FITC-FA-CS-NPs)和被動(dòng)納米粒(FITC-CS-NPs)，H22荷瘤小鼠尾靜脈分別注射上述兩種標(biāo)記藥物和FITC溶液后，于30min后活體熒光成像，隨即小鼠離體組織熒光成像。另取，H22荷瘤

4、小鼠分別尾靜脈給予FA-CS-LZ-NPs、CS-LZ-NPs和LZ，HPLC法分析在不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血漿與組織內(nèi)川芎嗪藥物濃度。
　　4.主動(dòng)靶向納米粒抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究。建立小鼠H22腫瘤轉(zhuǎn)移模型，隨機(jī)分為8組，分別給予:FA-CS-LZ-NPs(40mg/kg，高劑量)、(20mg/kg，中劑量)、(10mg/kg，低劑量)，CS-LZ-NPs(20mg/kg)，LZ(20mg/kg)，主動(dòng)空納米粒(FA-CS-NPs)，5-

5、FU(20mg/kg)，生理鹽水(0.2mL)。連續(xù)給藥21天，比較各組小鼠體重變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)移植瘤中MMP-9、VEGF的蛋白表達(dá)水平，比較各組小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.按照優(yōu)化處方(1mg/mL FA-CS，0.89mg/mL TPP, pH4.61)制備FA-CS-LZ-NPs，該納米粒的包封率為(36.72±0.65)％，載藥量為（9.44±0.17）％，粒徑為141.1±0.6 nm，分散度(

6、PDI)為0.219±0.011，Zeta電位為20.8±1.4 mv，可知實(shí)驗(yàn)觀察值和模型預(yù)測(cè)值都比較接近，模型預(yù)測(cè)性良好。
　　2.Western Boltting測(cè)得Bel7402、L-02細(xì)胞葉酸表達(dá)水平具有顯著性差異，可用于后續(xù)試驗(yàn)。主動(dòng)靶向納米粒對(duì)Bel7402、L-02細(xì)胞的無(wú)毒劑量是LZ47.5μg·mL-1。Bel7402和L-02細(xì)胞給藥4h后，胞內(nèi)川芎嗪濃度達(dá)到飽和，而且FA-CS-LZ-NPs組Bel740

7、2細(xì)胞內(nèi)LZ藥物濃度顯著高于CS-LZ-NPs組、LZ溶液組以及L-02細(xì)胞FA-CS-LZ-NPs組。說(shuō)明葉酸修飾的納米粒促進(jìn)了Bel7402對(duì)藥物的攝取。Hela、Bel7402、L-02三種細(xì)胞分別給予FA-CS-LZ-NPs處理，經(jīng)HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)川芎嗪濃度由高到低依次為Hela＞ Bel7402＞L-02，證明細(xì)胞內(nèi)藥物攝取量與細(xì)胞葉酸受體表達(dá)水平成正相關(guān)。
　　3.FITC-FA-CS與FA-CS相比，紅外圖譜中，在

8、1575cm-1處彎曲振動(dòng)增強(qiáng)，是殼聚糖的氨基與FITC的異硫氰根反應(yīng)的結(jié)果;核磁氫譜圖中，δ6.715，δ6.949 ppm處新增兩個(gè)位移值，為FITC芳烴質(zhì)子峰，證明FITC偶聯(lián)到葉酸殼聚糖骨架上。活體成像觀察發(fā)現(xiàn)，與注射FITC-CS-NPs和FITC溶液相比，注射FITC-FA-CS-NPs荷瘤小鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)。離體臟器成像和體內(nèi)LZ藥物分布結(jié)果顯示，主動(dòng)納米粒組在腫瘤組織的分布顯著高于被動(dòng)納米粒組、溶液組。經(jīng)過(guò)葉酸修

9、飾的納米粒主要集中在腫瘤、肝、腎部位，而未經(jīng)葉酸修飾的納米粒主要集中在肝、肺部位，溶液組中組織分布較少。
　　4.5-FU組小鼠體重呈下降趨勢(shì)，其他給藥組均有不同程度增長(zhǎng)，表明川芎嗪納米粒毒副作用小。MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性下調(diào)，且主動(dòng)靶向納米粒抑制效果較好。FA-CS-LZ-NPs與CS-LZ-NPs、LZ溶液相比，抑制肺部轉(zhuǎn)移瘤效果更好，呈劑量依賴性。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備出的葉酸殼聚