川芎嗪芪類(lèi)衍生物DLJ14和阿霉素合用抑制MCF-7-A細(xì)胞體內(nèi)外增殖作用的機(jī)制研究.pdf

1、川芎嗪(tetra methyl pyrazine，TMP)是傘形科蒿本屬植物川芎Ligusticumchuanxiong Hort根莖中分離提純的一種生物堿為中藥川芎的有效活性成分之一。目前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道TMP具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的活性，但由于甲基易被氧化而導(dǎo)致其半衰期短、生物利用度低，限制其臨床應(yīng)用。為了克服其缺點(diǎn)，我們合成了一系列川芎嗪芪類(lèi)衍生物并篩選出具有較好活性的DLJ14((E)-2-(2，4，-二甲氧基苯乙烯基)-3，5

2、，6-三甲基吡嗪）。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí):DLJ14能逆轉(zhuǎn)人慢性粒細(xì)胞性白血病耐阿霉素細(xì)胞株K562/A02和人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/A對(duì)阿霉素的耐藥性。但是，DLJ14和阿霉素合用后提高阿霉素抗腫瘤作用的機(jī)制并沒(méi)有完全闡明。本課題將進(jìn)一步探討川芎嗪芪類(lèi)衍生物DLJ14和阿霉素合用對(duì)人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/A體內(nèi)外增殖的抑制作用及作用機(jī)制。
　　首先，體外MTT實(shí)驗(yàn)表明:DLJ14和阿霉素合用能明顯增強(qiáng)對(duì)MCF-

3、7/A細(xì)胞的抑制作用，與阿霉素單用組比較有顯著性差異。體內(nèi)裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)表明:與陰性對(duì)照組相比，DLJ14單用(4mg/kg，8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)單用對(duì)阿霉素耐藥移植瘤的增殖抑制作用弱;而DLJ14(4mg/kg，8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)聯(lián)合用藥對(duì)阿霉素耐藥移植瘤的生長(zhǎng)有顯著抑制作用，與阿霉素單用組相比具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示DLJ14和阿霉素合用能將MCF-7/A細(xì)胞阻滯在G2/M期，該阻滯

4、作用與升高P53蛋白和P21蛋白表達(dá)，降低CyclinA蛋白表達(dá)有關(guān)。Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)和AnnexinⅤ-FITC/Propidiumiodide(PI)雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用能顯著誘導(dǎo)MCF-7/A細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)明顯的染色質(zhì)濃縮、聚集在核周邊或核膜破裂的現(xiàn)象，晚期凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多。Westernblotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:Bax/Bcl-2比率、cleavedc

5、aspase-9和cleavedcaspase-3蛋白量均明顯增多。JC-1檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位和Westernblotting分別檢測(cè)線(xiàn)粒體和胞漿中cytochromec蛋白量，結(jié)果顯示:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用組去極化線(xiàn)粒體的細(xì)胞比例增多，即細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電勢(shì)降低，cytochromec從線(xiàn)粒體釋放到胞漿，表明MCF-7/A細(xì)胞發(fā)生凋亡可能通過(guò)線(xiàn)粒體通路。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DLJ14和阿霉素

6、合用可抑制細(xì)胞EGFR和PI3K蛋白的表達(dá)及細(xì)胞存活信號(hào)EGFR和Akt的磷酸化，而對(duì)非磷酸化Akt蛋白的表達(dá)量無(wú)影響。上述結(jié)果表明DLJ14和阿霉素合用后可通過(guò)抑制EGFR/PI3K/Akt細(xì)胞存活信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，加強(qiáng)阿霉素的細(xì)胞毒作用。
　　其次，探討了DLJ14對(duì)ABC超家族耐藥相關(guān)蛋白P-gp和BCRP的影響。P-gp底物羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積實(shí)驗(yàn)表明:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用組中羅丹明

7、123的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，即羅丹明123外排減少，細(xì)胞內(nèi)蓄積增多。細(xì)胞內(nèi)ATP含量測(cè)定和細(xì)胞中Ca2+-Mg2+ATPase活性檢測(cè)表明:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用組中ATP含量和Ca2+-Mg2+ATPase活性均顯著降低。Westernblotting進(jìn)一步分析顯示:與單用阿霉素比較，DLJ14和阿霉素合用后能明顯降低細(xì)胞中ERK、P-ERK、P-gp和BCRP蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明DLJ14和阿霉素合用能通過(guò)抑制A