大花旋覆花內(nèi)酯及其衍生物抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制.pdf

1、歐亞旋覆花屬菊科植物，屬辛溫之藥，入肺、大腸經(jīng)，具有消痰、行水、降氣、止嘔、抗菌、消炎和鎮(zhèn)痛之功效，主要用于治療胸中痰結(jié)、脅下脹滿、咳喘、呃逆、心下痞硬、大腹水腫等癥。構(gòu)一效分析表明，從歐亞旋覆花中分離提取的活性單體--大花旋覆花內(nèi)酯（1-O-acetylbritannilactone，ABL），可通過阻斷核因子-kB（nuclearflactor-kappaB，NF-kB）信號通路抑制炎性因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（vascularsm

2、oothmusclecell，VSMC）的炎癥應(yīng)答，對損傷引起的血管內(nèi)膜增生具有明顯的預(yù)防作用；6位引入酯?；?，6-O2-ABL具有更強(qiáng)的抗炎作用。細(xì)胞的過度增殖是炎癥誘發(fā)血管狹窄和腫瘤形成的主要病理機(jī)制，ABL除了抑制炎癥應(yīng)答外，是否能夠直接抑制細(xì)胞的過度增殖尚不清楚。本研究從細(xì)胞和整體水平上系統(tǒng)觀察了ABL及其修飾衍生物對VSMC和乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，進(jìn)而探討其作用機(jī)制。旨在挖掘ABL新的藥理效應(yīng)，為擴(kuò)展藥物研發(fā)提供依據(jù)。

3、
　　 1.ABL抑制血小板源性生長因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）誘導(dǎo)的VSMC增殖及其機(jī)制動脈粥樣硬化、冠狀動脈血管成形術(shù)后再狹窄等慢性炎性病變主要涉及血管內(nèi)膜的損傷并由此導(dǎo)致的VSMC的遷移和增殖。局部炎癥引起血小板聚集，暴露于管腔的VSMC以及內(nèi)皮細(xì)胞在各種因素的刺激下可釋放出多種細(xì)胞因子。其中，PDGF可通過活化細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而促進(jìn)VSMC遷移和增殖，在血管新生內(nèi)膜形成過

4、程中起著重要作用。本研究證實(shí)ABL通過阻斷PDGF激活的ERK1/2信號級聯(lián)而抑制DNA的合成，抑制VSMC增殖，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 1.1ABL抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCDNA合成和細(xì)胞增殖采用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予PDGF（20ng/ml）刺激VSMC24h后，細(xì)胞增殖活性明顯增高。而ABL（5、10、20μM）與PDGF共同作用24h后，VSMC增殖活性明顯下降。細(xì)胞計(jì)數(shù)分析也觀察的相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而單獨(dú)應(yīng)用10

5、μMABL處理VSMC24h，細(xì)胞的DNA合成和增殖活性未見明顯改變。提示ABL可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖而對靜止的細(xì)胞無影響。
　　 1.2ABL使PDGF誘導(dǎo)VSMC的細(xì)胞周期停滯于G1期流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，ABL（10、20μM）與PDGF（20ng/ml）共同作用VSMC24h后，處于G1期的細(xì)胞數(shù)較PDGF組明顯增加，與此同時(shí)，S期細(xì)胞數(shù)目明顯減少。提示ABL抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖的作用與細(xì)胞周期進(jìn)程被阻

6、滯于G1期有關(guān)。
　　 1.3ABL通過上調(diào)p21而抑制細(xì)胞周期素（cyclins）和細(xì)胞周期素依賴激酶（CDKs）的表達(dá)用不同濃度ABL（5、10、20μM）與PDGF（20ng/ml）共同作用VSMC24h后，Westernblot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，ABL可劑量依賴性地抑制cyclinD1、cyclinA、cyclinE、CDK2、CDK4和CDK6的表達(dá)。此外，免疫共沉淀分析表明，ABL（20μM）可明

7、顯抑制p21-CDKs復(fù)合物的形成。這說明ABL阻滯VSMC周期進(jìn)程與抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)與活性有關(guān)。
　　 1.4ABL可通過活化Caspauses促進(jìn)VSMC的凋亡細(xì)胞凋亡分析結(jié)果表明，ABL（5、10、20μM）與PDGF（20ng/ml）共同作用VSMC24h后，VSMC凋亡率較單純PDGF（20ng/ml）刺激組顯著升高。隨著ABL劑量的增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)逐漸升高，而抑凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2的表達(dá)逐

8、漸下降。此外，還發(fā)現(xiàn)ABL可通過誘導(dǎo)Caspase-3與Caspase-9的活性而促進(jìn)VSMC凋亡。
　　 1.5ABL抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC遷移平面遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABL（5、10、20μM）可劑量依賴性地抑制PDGF（20ng/ml）誘導(dǎo)的VSMC遷移?？缒みw移實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，ABL不僅可以顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC跨膜遷移，而且對于靜止的VSMC遷移同樣具有抑制作用。
　　 1.6ABL抑制PDGF誘導(dǎo)的

9、ERK1/2信號通路的激活免疫共沉淀分析結(jié)果顯示，ABL（5、10、20μM）可劑量依賴性地抑制PDGF（20ng/ml）誘導(dǎo)的PDGF受體（PDGFR）的磷酸化，對PDGFR下游的MEK1/2、ERK1/2的激活分析顯示，增加的MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平也隨著ABL濃度的增加而逐漸降低。通過轉(zhuǎn)染持續(xù)激活的MEK1/2表達(dá)質(zhì)粒pCMV-MEK1，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)制活化的ERK1/2可部分逆轉(zhuǎn)ABL處理所致的VSMC增殖抑制，提示抑制E

10、RK1/2信號通路的活化是ABL抗VSMC增殖的重要環(huán)節(jié)。
　　 1.7ABL抑制球囊損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成為了確定ABL在體內(nèi)的抗VSMC增殖活性，建立大鼠頸總動脈內(nèi)皮球囊損傷模型。形態(tài)學(xué)分析顯示，給予ABL（26mg/kg/day）的大鼠，球囊損傷誘導(dǎo)的血管新生內(nèi)膜的增生程度較單純球囊損傷組明顯減輕，其面積分別為0.05±0.02m㎡和0.15±0.04m㎡，兩者比較具有顯著性差異（P<0.01）。對血管組織切片進(jìn)行TUNE

11、L染色發(fā)現(xiàn)，ABL組新生內(nèi)膜中陽性染色細(xì)胞數(shù)目較球囊損傷組明顯升高，提示ABL可誘導(dǎo)新生內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 綜上所述，ABL可以阻斷PDGF激活的ERK1/2信號通路，從而阻滯VSMC細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞DNA的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且可以抑制大鼠頸總動脈球囊損傷模型中血管新生內(nèi)膜的形成。
　　 2.ABL與Ceiecoxib協(xié)同抑制環(huán)加氧酶-2（COX-2）的表達(dá)和乳腺癌細(xì)胞的生長以往研究證實(shí)，ABL具有抑制

12、COX-2表達(dá)和PGE2釋放的作用，但是ABL在腫瘤治療方面是否具有成藥性尚不清楚。COX-2特異抑制劑Celecoxib在乳腺癌的治療和預(yù)防方面的有效性已得到臨床證實(shí)，但是由于其副作用多的缺點(diǎn)而限制了該藥的應(yīng)用?；贏BL和Celeeoxib具有相似的作用靶點(diǎn)，本研究探討了二者聯(lián)用對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，并對其抗腫瘤活性和藥理機(jī)制進(jìn)行了評價(jià)。
　　 2.1ABL和Celecoxib協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖將。
　　 2

13、.2ABL和Celecoxib協(xié)同誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。
　　 2.3ABL和Celecoxib協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞COX-2表達(dá)和活性。
　　 2.4ABL和Celecoxib協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞COX-2基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。
　　 2.5ABL和Celecoxib協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞中Akt和p38信號通路的激活A(yù)kt和MAPK信號通路在介導(dǎo)COX-2基因的轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述，在細(xì)胞和整

14、體水平上，ABL可以通過抑制乳腺癌細(xì)胞COX-2的表達(dá)和激活從而協(xié)同增強(qiáng)Celecoxib的抗腫瘤效應(yīng)，為兩者的聯(lián)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 3.ABL衍生物ABL-N通過激活JNK信號通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡以往研究表明，ABL抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用較弱，為了提高ABL的效力和成藥性，對ABL的6-OH進(jìn)行修飾，篩選得到ABL-N?；钚苑治鲲@示，ABL-N對多種腫瘤細(xì)胞株的增殖具有很強(qiáng)的抑制效應(yīng)。在前期研究的基礎(chǔ)上，本部分

15、重點(diǎn)觀察了ABL-N對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并且通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對ABL-N的抗瘤活性進(jìn)行了評價(jià)。
　　 3.1ABL-N抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
　　 3.2ABL-N阻滯乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　 3.3ABL-N通過誘導(dǎo)Caspases活化而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。
　　 3.4ABL-N對乳腺癌細(xì)胞中Bcl-2家族成員表達(dá)的差異調(diào)節(jié)。
　　 3.5ABL-N誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MAPK信號

16、途徑的激活。
　　 3.6ABL-N抑制MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠體內(nèi)異種移植瘤的生長。
　　 總之，ABL-N是一種具有較廣的抗腫瘤譜的化合物，可通過誘導(dǎo)Caspases活化、激活JNK信號通路促進(jìn)體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，抑制體內(nèi)腫瘤生長。
　　 結(jié)論
　　 1.ABL通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)凋亡而抑制VSMC增殖和損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生。
　　 2.在細(xì)胞和整體水平上，ABL通過抑制乳腺