旋覆花內(nèi)酯衍生物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26增殖和凋亡的影響.pdf

1、結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤。結(jié)腸癌的治療目前主要是采用手術(shù)根治切除治療,輔以放化療預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。以往的研究發(fā)現(xiàn),旋覆花的一種倍半萜類化合物——旋覆花內(nèi)酯(ABL)具有影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,但其穩(wěn)定性和溶解性都不太好。本實(shí)驗(yàn)用的是旋覆花內(nèi)酯衍生物(ABL-N),在體外以不同濃度的ABL-N處理結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26,觀察其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 目的:
　　 (1)觀察ABL-N對(duì)

2、CT26細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 (2)觀察ABL-N對(duì)CT26細(xì)胞周期的影響。
　　 (3)觀察ABL-N對(duì)CT26凋亡的影響,并進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)凋亡的可能的機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)MTT法檢測(cè)ABL-N對(duì)CT26細(xì)胞增殖的影響:以不同濃度ABL-N處理CT26細(xì)胞24 h,進(jìn)行MTT法檢測(cè),根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平均OD值計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖抑制率。
　　 (2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一

3、步檢測(cè)ABL-N對(duì)CT26增殖能力的影響:實(shí)驗(yàn)組以不同濃度ABL-N處理已貼壁的CT26細(xì)胞24 h,再以新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)9 d,對(duì)照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間,染色,計(jì)數(shù)各組克隆數(shù),計(jì)算各組克隆形成率。
　　 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率及周期分布:實(shí)驗(yàn)組以ABL-N處理CT26細(xì)胞24 h,對(duì)照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
　　 (4)透射電鏡

4、技術(shù)檢測(cè)CT26細(xì)胞經(jīng)ABL-N處理后細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變:實(shí)驗(yàn)組以ABL-N處理CT26細(xì)胞24 h,對(duì)照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,進(jìn)行透射電鏡檢測(cè)。
　　 (5)細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)CT26細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9基因的表達(dá):實(shí)驗(yàn)組以不同濃度ABL-N處理CT26細(xì)胞24 h,對(duì)照組在同樣條件下以溶劑培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,進(jìn)行免疫熒光染色,固定,封閉,一抗4℃孵育過(guò)

5、夜,二抗室溫孵育2 h,激光共聚焦顯微鏡掃描。比較各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度,進(jìn)而比較各組細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9基因表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果:
　　 (1)MTT結(jié)果:5、10、20和40mg/L ABL-N實(shí)驗(yàn)組的抑制率分別為1.6％、16.9％、53.4％和92.1％,5mg/L ABL-N組OD值雖比對(duì)照組小,但與對(duì)照組比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),10、20和40mg/L ABL-N均可明顯

6、抑制CT26細(xì)胞的增殖(P＜0.05或P＜0.01),其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26增殖的抑制作用具有濃度依賴性。
　　 (2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5、10和20mg/L的ABL-N作用24 h后繼續(xù)培養(yǎng)9 d的CT26細(xì)胞的克隆形成率分別為(44.7±3.8)％、(28.6±2.5)％和(4.6±1.4)％,40mg/L.ABL-N作用后的CT26細(xì)胞沒有克隆形成,與對(duì)照組克隆形成率(53.4±1.9)％相比,5mg/L即可明顯抑

7、制CT26細(xì)胞的克隆形成(P＜0.05),而10、20和40mg/L的抑制作用更強(qiáng)(P＜0.01),ABL-N抑制CT26細(xì)胞克隆形成作用亦呈明顯的濃度依賴性。
　　 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果:20mg/L ABL-N處理24 h的CT26細(xì)胞周期分布為G1期87.5％,S期11.8％,細(xì)胞凋亡率為55.8％,與對(duì)照組結(jié)果G1期67.9％,S期29.6％,細(xì)胞凋亡率4.14％比較,顯示ABL-N可以通過(guò)阻滯CT26的細(xì)胞周期,影

8、響細(xì)胞的生長(zhǎng),并且具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　 (4)透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài):20mg/L ABL-N處理24 h的CT26細(xì)胞在透射電鏡下可見細(xì)胞質(zhì)電子密度增加,可見許多空泡,胞質(zhì)中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少,部分核膜向內(nèi)反折呈銳角突起或呈球形膨出,核固縮,大部分核膜缺失,核內(nèi)容物外排到細(xì)胞質(zhì)中,核染色質(zhì)高度濃縮,形成凋亡細(xì)胞特有的“半月”狀。
　　 (5)免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Caspas

9、e-3和Caspase-9基因表達(dá)的結(jié)果:20和40mg/L ABL-N組細(xì)胞質(zhì)中的Caspase-3和Caspase-9基因表達(dá)均明顯比對(duì)照組高(P＜0.01),且40mg/LABL-N比20mg/L ABL-N作用更強(qiáng)(P＜0.01),即.ABL-N濃度依賴性地誘導(dǎo)CT26細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)ABL-N對(duì)CT26細(xì)胞的增殖有抑制作用,且其抑制作用呈