MiR-375對人結(jié)腸癌細胞株HCT116的生物學功能的影響.pdf

1、目的：
　　脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-375 mimics轉(zhuǎn)入HCT116細胞上調(diào)miR-375的表達，用實時定量-PCR法檢測miR-375和AEG-1 mRNA的表達情況;MTT法檢測細胞活力的改變情況;流式細胞技術(shù)檢測miR-375對細胞凋亡及細胞周期的影響;我們通過研究miR-375對結(jié)腸癌細胞株HCT116生物學行為的影響，旨在為結(jié)腸癌的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.材料:人結(jié)直腸癌細胞株

2、Caco2、HCT116、SW480、SW620均購自CTCC（中國模式培養(yǎng)物集存庫Chinese Type Culture Collection，中國北京）;DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco公司;0.25％胰蛋白酶購自杭州吉諾生物有限公司;miR-375 mimics和negative control轉(zhuǎn)染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectmanine TM2000及TRIzol試

3、劑均購自美國Invitrogen公司;噻唑藍(MTT)購自廣州威佳公司;二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;細胞周期及凋亡檢測試劑盒購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司;SYBRPremix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)為TaKaRa公司產(chǎn)品。
　　2.細胞培養(yǎng):Caco2、HCT116用含10％

4、胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，SW480、SW620用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:置于37℃、CO2體積分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況每1～2d換液培養(yǎng)1次，當細胞覆蓋瓶底壁大部分表面時，進行細胞傳代或收集細胞。
　　3.實時定量-PCR檢測不同結(jié)直腸癌細胞中miR-375的表達情況:收集細胞，按照TRIzol試劑說明書抽提結(jié)直腸癌細胞株Caco2、HCT116、SW620和SW4

5、80中的總RNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用實時定量-PCR檢測結(jié)直腸癌細胞中miR-375的表達，以U6作為內(nèi)參，引物均購自廣州銳博公司。結(jié)果采用2-△Ct法計算目的基因的相對表達量，△Ct=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值。
　　4.細胞轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1d，將適量（約4×104～5×104）生長狀態(tài)穩(wěn)定的HCT116細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)板上，每孔加入不含抗生素的細胞培養(yǎng)液400μL。密切觀察細胞生長情況，當細胞密度達到30

6、％～50％時，開始進行實驗組(miR-375 mimics)和對照組（negative control，NC）的轉(zhuǎn)染。用50μL不含血清的培養(yǎng)基Opti-MEM對5μL濃度為20μmol/L的miR-375 mimics和negativecontrol進行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。用50 tL的不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM對1.5μL Lipofectmanine TM2000進行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 mi

7、n。將稀釋好的miR-375 mimics和negative control與LipofectmanineTM2000混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min，以形成混合物。100μL混合物加到培養(yǎng)板的孔中，輕輕搖晃細胞培養(yǎng)板使其與培養(yǎng)液混勻。將細胞培養(yǎng)板置于CO2體積分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)6h后，移除每孔中含有混合物的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液。繼續(xù)在37℃、CO2體積分數(shù)為5％的條件下培養(yǎng)24 h后，進行轉(zhuǎn)染后的其他實驗檢測

8、。
　　5.實時定量-PCR檢測各轉(zhuǎn)染組細胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達情況:轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，按照TRIzol說明書抽提細胞中的總RNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量-PCR檢測結(jié)腸癌細胞中miR-375的表達，以U6作為內(nèi)參照，引物購自廣州銳博公司。實時熒光定量-PCR檢測細胞中AEG-1mRNA的表達情況，以GAPDH作為內(nèi)參，引物購自TaKaRa公司。結(jié)果采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達

9、量，△Ct=目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值。
　　6.MTT法檢測細胞的生長情況:將轉(zhuǎn)染后的實驗組和陰性對照組細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種細胞約3000個（每孔加培養(yǎng)液100μL），置于37℃、CO2體積分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)4h、24 h、48 h和72 h后加入MTT工作液，每孔加入0.5％ MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，輕輕吸出孔內(nèi)液體，然后在每孔中加入二甲基亞砜150μL，應用全自動酶

10、標儀，檢測波長490 nm下的吸光度(OD)值。以時間作為橫坐標，計算所得OD值的均數(shù)為縱坐標，繪制細胞生長曲線。
　　7.流式細胞術(shù)檢測細胞周期:轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細胞，制成單細胞懸液，然后1200 r/min離心5 min，棄上清。預冷PBS洗滌細胞2次，PI細胞染色，即加入1000μL staining buffer(A)及10μL reagent B染色，混勻后室溫避光孵育30 min，立即上流式細胞儀進行檢測。

11、>　　8.流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡:轉(zhuǎn)染48 h后消化收集細胞，制成單細胞懸液，然后1200 r/min離心5 min，棄上清。預冷PBS洗滌細胞2次，用500μL1×binding buffer重懸細胞，加入5μL FITC標記的annexin-Ⅴ，加入10μL的PI?；靹蚝笫覝乇芄夥跤? min，立即上流式細胞儀檢測。
　　9.應用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有的細胞學實驗均重復3次，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標

12、準差(mean±SD)表示，符合正態(tài)分布且方差齊者采用t檢驗或者ANOVA檢驗，方差不齊采用Dunnett T3校正，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.miR-375在結(jié)腸癌細胞株中的表達情況:提取結(jié)直腸癌細胞株(Caco2、HCT116、SW620、SW480)中的總RNA，以U6作為內(nèi)參，運用實時定量-PCR法檢測miR-375的相對表達量。結(jié)果采用2-△Ct法計算miR-375的相對表達量。其中以HC

13、T116細胞中miR-375的表達水平最低，因此選取HCT116細胞株作為我們進一步研究的對象。
　　2.miR-375 mimics對HCT116細胞中miR-375和AEG-1 mRNA表達的影響:miR-375 mimics瞬時轉(zhuǎn)染HCT116細胞48 h后，采用實時定量-PCR檢測轉(zhuǎn)染后實驗組及陰性對照組HCT116細胞中miR-375和AEG-1 mRNA的表達水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-375 mimic后miR-37

14、5的表達水平明顯上調(diào)，其表達水平約是陰性對照組的2000倍(P＜0.01)，同時miR-375的高表達導致AEG-1mRNA表達下調(diào)(P＜0.05)。以上結(jié)果提示，miR-375 mimics可上調(diào)miR-375的表達，同時過表達miR-375可抑制AEG-1 mRNA的表達。
　　3.miR-375過表達對HCT116細胞生長的影響:MTT法檢測結(jié)果顯示，miR-375 mimics組細胞轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時的OD

15、值均低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。miR-375過表達對HCT116細胞的活力具有明顯抑制作用。
　　4.miR-375過表達對HCT116細胞周期的影響:流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染48h后各組細胞的周期分布，結(jié)果顯示，miR-375 mimics組與陰性對照組在G1期、S期和G2期細胞所占比例分別為（68.323±2.975）％vs（54.973±3.056）％、(16.443±0.422)％vs(27.767±3.

16、636)％、（14.200±0.943)％vs(17.26±2.268)％,2組間經(jīng)比較，miR-375 mimics組G1期細胞所占比例明顯增多(P＜0.01)，S期細胞所占比例明顯減少(P＜0.05)。
　　5.miR-375過表達對HCT116細胞凋亡率的影響:流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染48h后各組細胞的凋亡率，結(jié)果顯示，miR-375mimics組和陰性對照組的細胞凋亡率分別為（8.468±1.546）％和（6.252±1.201

17、）％，陰性對照組的細胞凋亡率明顯低于miR-375 mimics組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.miR-375mimics組中miR-375表達量較對照組明顯上調(diào);miR-375抑制結(jié)腸癌細胞HCT116的細胞活性，介導細胞周期阻滯并促進其凋亡。
　　2.miR-375高表達可以顯著抑制AEG-1 mRNA的表達水平，miR-375作為一種抑癌因子，在結(jié)腸癌中可能通過抑制癌基因AEG-1的表