STAT3短發(fā)夾RNA的構(gòu)建及其對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高,結(jié)腸癌發(fā)病率呈城市化、年輕化上升趨勢(shì),平均發(fā)病年齡較國(guó)外低10歲,嚴(yán)重影響了國(guó)民的健康。因此尋求新的診斷和治療的有效方法日趨迫切。而結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展是一多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程。外科手術(shù)仍是目前治療結(jié)直腸癌的核心手段,圍繞手術(shù)開(kāi)展的化學(xué)治療雖然能在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存時(shí)限,卻無(wú)法回避針對(duì)性差、毒副作用大等缺陷。隨著生物技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展和從細(xì)胞分子水平對(duì)發(fā)病機(jī)制

2、的深入認(rèn)識(shí),腫瘤生物治療已進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。
　　 癌變是細(xì)胞分化異常、增殖過(guò)度與凋亡受阻的結(jié)果,STAT3是轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子與激活子家族(signal transducers and activators oftranscdption,STAT)的重要成員,STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān),該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化,目前定義為癌基因。近年研究發(fā)現(xiàn),STAT3是多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通

3、道匯聚的焦點(diǎn),包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及非受體酪氨酸激酶等。但STAT3并不直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,而是通過(guò)對(duì)其下游靶基因的調(diào)控來(lái)影響腫瘤的進(jìn)程。STAT3的下游靶基因如Bcl-x1、Bcl22、Mcl21、cyclinD1、c-Myc、c-jun、Fas、p21WAFI/CIPI和VEGF等都與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。越來(lái)越多的證據(jù)表明STAT3在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中異常激活,且與腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)密切相關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞和組織中都有過(guò)度激

4、活,如前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等。
　　 研究發(fā)現(xiàn)STAT3在雞肉瘤病毒(Rous Sarcoma Vh'us,v-Src)轉(zhuǎn)染的胞內(nèi)持續(xù)磷酸化；蛋白酪氨酸激酶-2(Janus2,JAK2)磷酸化抑制劑AG490能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中的STAT3激活,進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)；前列腺癌細(xì)胞株中STAT3被激活,反義STAT3能夠誘發(fā)痛細(xì)胞凋亡。但目前對(duì)與結(jié)直腸癌相關(guān)的STAT3系統(tǒng)性研究甚少。Ma等用Western

5、blot法檢測(cè)了45例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中p-STAT3(活化狀態(tài)的STAT3)、cyclin D1和Bcl2x1蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平明顯高于正常腸黏膜。Kusaba等檢測(cè)了108例人結(jié)直腸腺癌組織中p-STA T3的表達(dá),結(jié)果顯示57.4％的組織高表達(dá),其表達(dá)與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期及術(shù)后的預(yù)后有關(guān),提示p-STAT13蛋白的高表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。Lassmann等采用RT-PCR

6、法檢測(cè)32例結(jié)直腸癌組織,結(jié)果顯示STAT3、p-STAT3蛋白及其靶基因cyclinD1、survivin和Bcl2x1的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸組織,并通過(guò)誘導(dǎo)靶基因survivin、Bcl2x1的表達(dá),促使腫瘤細(xì)胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,為結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究提供了具有判斷預(yù)后價(jià)值的新的分子標(biāo)志物。
　　 Redell等提出阻斷轉(zhuǎn)錄因子可能足治療腫瘤最為有效的方法之一。目前,阻斷STAT3信號(hào)通路治療結(jié)直腸癌的方法主要是,針對(duì)STAT

7、的顯性負(fù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反義寡核苷酸阻斷、RNA干擾阻斷等直接阻斷,針對(duì)STAT上游的酪氨酸激酶采用特異性抑制劑的間接阻斷。研究結(jié)果都表明阻斷STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療結(jié)直腸癌的策略是可行的。因此尋找高效抑制STAT3表達(dá)的治療方法,一直是研究的熱點(diǎn)。
　　 一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞增殖活性是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和前提,但侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)現(xiàn)還取決于腫瘤細(xì)胞對(duì)正常組織的破壞能力、腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力以及對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移中所遭遇環(huán)境的適應(yīng)性等因素?；|(zhì)金屬

8、蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分,在結(jié)腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用,尤其是有基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetaUoproteinases-9,MMP-9)表達(dá)的結(jié)腸癌,其侵襲力更強(qiáng),預(yù)后更差。
　　 1998年RNAi的發(fā)現(xiàn),特別是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)用短發(fā)央RNA(smallinterfering RNA,siRNA)成功介導(dǎo)RNAi,為基因功

9、能的研究提供了強(qiáng)大的武器,也為結(jié)腸癌基因治療增添了新的活力,發(fā)現(xiàn)RNAi的科學(xué)家安德魯·法爾和克雷格·梅洛也因此獲得2006年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。
　　 RNAi現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的體內(nèi)序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默過(guò)程。其作用機(jī)制是dsRNA被核酸內(nèi)切酶Ⅲ樣蛋白加工成21～25個(gè)核苷酸組成的siRNA,siRNA與解旋酶、核酸酶及一些相關(guān)因子結(jié)合成RNA誘導(dǎo)

10、沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC在siRNA引導(dǎo)下,特異地切割與siRNA同源的靶mRNA,使其降解,細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。由于RNAi對(duì)染色體DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程不產(chǎn)生影響,具有特異性、高效性、對(duì)dsRNA長(zhǎng)度依賴性和靶mRNA切割位點(diǎn)確定性等特點(diǎn),所以,迅速成為一種功能強(qiáng)大的、選擇性抑制特異基因表達(dá)的工具,也為腫瘤的基因治療提供了新方法。目前有體外化學(xué)合成、體

11、外轉(zhuǎn)錄(應(yīng)用T7啟動(dòng)子)和應(yīng)用DNA載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄3種方式生成siRNA,其中DNA載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄方法是利用U6啟動(dòng)子,構(gòu)建siRNA表達(dá)載體,在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)siRNA,能長(zhǎng)期沉默真核細(xì)胞內(nèi)特定基因。RNAi技術(shù)可以針對(duì)信號(hào)通路的多個(gè)基因或者基因族的共有序列來(lái)同時(shí)抑制多個(gè)基因的表達(dá),從而能更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。目前已經(jīng)在病毒感染、腫瘤和遺傳性疾病中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),取得了良好的效果?，F(xiàn)在,第一個(gè)RNAi藥物Bevasiranib(Acuit

12、yPharmaceuticals公司)已經(jīng)誕生。2004年FDA批準(zhǔn)Bevasiranib進(jìn)行臨床試驗(yàn)。2006年9月12日,公司公布Bevasiranibsodium(Cand5)的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果:Bevasiranib能夠減緩患者眼睛中血管的生長(zhǎng)并改善視力。目前,FDA已經(jīng)批準(zhǔn)Bevasiranib進(jìn)入In期臨床實(shí)驗(yàn)。
　　 本研究構(gòu)建針對(duì)STAT3基因的shRNA表達(dá)載體,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,利用RNA

13、i特異性沉默結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中STAT3,觀察RNA干擾STAT3后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡的影響；并觀察對(duì)MMP-9的表達(dá)的影響,研究其在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。為以STAT3為靶基因、以RNAi為方法的結(jié)腸癌基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株,提取質(zhì)粒,設(shè)計(jì)并構(gòu)建以STAT3為靶基因的短發(fā)夾狀小干擾RNA表達(dá)載體。探討STAT3短發(fā)夾RNA表達(dá)載體對(duì)人結(jié)腸癌HCT

14、116細(xì)胞增埴、凋亡和侵襲的影響。
　　 方法
　　 體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株,并根據(jù)NCBI提供的人類Stat3基因結(jié)構(gòu)(Gene ID:6774)和shRNA的設(shè)計(jì)原則,參考相關(guān)文獻(xiàn)選取特異性序列為干擾作用的靶點(diǎn),設(shè)計(jì)合成1個(gè)可干擾序列,并設(shè)計(jì)一條經(jīng)BLAST檢索與現(xiàn)有基因文庫(kù)中所有人源基因均無(wú)同源性的非特異性序列為陰性對(duì)照序列。采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,粗提物離心除去內(nèi)毒素,然后選擇性地結(jié)合溶液中

15、的質(zhì)粒DNA,將雜質(zhì)和其它細(xì)藺成分去除,抽提純凈質(zhì)粒DNA。同時(shí)以pGPU6/GFP/STAT3質(zhì)粒為載體,構(gòu)建STAT3的短發(fā)央RNA表達(dá)載體,并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定。
　　 使用脂質(zhì)體法將STAT3的短發(fā)夾RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為4組,空白對(duì)照組、短發(fā)夾RNA組、陰性對(duì)照組與脂質(zhì)體對(duì)照組共四組。抽提各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)行擴(kuò)增,并檢測(cè)pGPU6/GFP

16、/STAT3轉(zhuǎn)染HCT116后STAT3mRNA表達(dá)改變,通過(guò)FTC-2000A檢測(cè)樣本Ct值；細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后應(yīng)用Western blot法檢測(cè)pGPU6/GFP/STAT3轉(zhuǎn)染HCT116后STAT3蛋白表達(dá)改變并進(jìn)行比較；四氮唑藍(lán)比色還原法(MTT法)檢測(cè)pGPU6/GFP/STAT3 shRNA轉(zhuǎn)染HCT116后對(duì)其生長(zhǎng)抑制效應(yīng)；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)cyclinD1的表達(dá)量及時(shí)相,分析四組細(xì)胞周期分布與凋亡的變化。轉(zhuǎn)染細(xì)

17、胞分為4組,空白對(duì)照組、短發(fā)央RNA組、陰性對(duì)照組與脂質(zhì)體對(duì)照組共四組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用免疫組化法檢測(cè)四組MMP-9的蛋白表達(dá)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞愈合能力；Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行癌細(xì)胞體外侵襲力分析。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)研究表明:①短發(fā)夾RNA可以特異性抑制HCT116的STAT3mRNA表達(dá),且效果顯著；②通過(guò)特異性沉默STAT3基因表達(dá),可以有效地抑制癌細(xì)胞增殖；③同時(shí)可使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0.G