STAT3短發(fā)夾RNA的構(gòu)建及其對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著我國人民生活水平的不斷提高,結(jié)腸癌發(fā)病率呈城市化、年輕化上升趨勢,平均發(fā)病年齡較國外低10歲,嚴(yán)重影響了國民的健康。因此尋求新的診斷和治療的有效方法日趨迫切。而結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展是一多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。外科手術(shù)仍是目前治療結(jié)直腸癌的核心手段,圍繞手術(shù)開展的化學(xué)治療雖然能在一定程度上延長患者的生存時(shí)限,卻無法回避針對性差、毒副作用大等缺陷。隨著生物技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展和從細(xì)胞分子水平對發(fā)病機(jī)制

2、的深入認(rèn)識,腫瘤生物治療已進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。
　　 癌變是細(xì)胞分化異常、增殖過度與凋亡受阻的結(jié)果,STAT3是轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)子與激活子家族(signal transducers and activators oftranscdption,STAT)的重要成員,STAT3信號傳導(dǎo)通路與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡密切相關(guān),該通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化,目前定義為癌基因。近年研究發(fā)現(xiàn),STAT3是多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號通

3、道匯聚的焦點(diǎn),包括生長因子、細(xì)胞因子及非受體酪氨酸激酶等。但STAT3并不直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,而是通過對其下游靶基因的調(diào)控來影響腫瘤的進(jìn)程。STAT3的下游靶基因如Bcl-x1、Bcl22、Mcl21、cyclinD1、c-Myc、c-jun、Fas、p21WAFI/CIPI和VEGF等都與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明STAT3在多種腫瘤組織與細(xì)胞系中異常激活,且與腫瘤對治療的反應(yīng)密切相關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞和組織中都有過度激

4、活,如前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等。
　　 研究發(fā)現(xiàn)STAT3在雞肉瘤病毒(Rous Sarcoma Vh'us,v-Src)轉(zhuǎn)染的胞內(nèi)持續(xù)磷酸化；蛋白酪氨酸激酶-2(Janus2,JAK2)磷酸化抑制劑AG490能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中的STAT3激活,進(jìn)而抑制腫瘤的生長；前列腺癌細(xì)胞株中STAT3被激活,反義STAT3能夠誘發(fā)痛細(xì)胞凋亡。但目前對與結(jié)直腸癌相關(guān)的STAT3系統(tǒng)性研究甚少。Ma等用Western

5、blot法檢測了45例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織中p-STAT3(活化狀態(tài)的STAT3)、cyclin D1和Bcl2x1蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平明顯高于正常腸黏膜。Kusaba等檢測了108例人結(jié)直腸腺癌組織中p-STA T3的表達(dá),結(jié)果顯示57.4％的組織高表達(dá),其表達(dá)與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期及術(shù)后的預(yù)后有關(guān),提示p-STAT13蛋白的高表達(dá)與結(jié)直腸腺癌的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。Lassmann等采用RT-PCR

6、法檢測32例結(jié)直腸癌組織,結(jié)果顯示STAT3、p-STAT3蛋白及其靶基因cyclinD1、survivin和Bcl2x1的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸組織,并通過誘導(dǎo)靶基因survivin、Bcl2x1的表達(dá),促使腫瘤細(xì)胞增殖和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,為結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)研究提供了具有判斷預(yù)后價(jià)值的新的分子標(biāo)志物。
　　 Redell等提出阻斷轉(zhuǎn)錄因子可能足治療腫瘤最為有效的方法之一。目前,阻斷STAT3信號通路治療結(jié)直腸癌的方法主要是,針對STAT

7、的顯性負(fù)競爭性抑制、反義寡核苷酸阻斷、RNA干擾阻斷等直接阻斷,針對STAT上游的酪氨酸激酶采用特異性抑制劑的間接阻斷。研究結(jié)果都表明阻斷STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路治療結(jié)直腸癌的策略是可行的。因此尋找高效抑制STAT3表達(dá)的治療方法,一直是研究的熱點(diǎn)。
　　 一般認(rèn)為腫瘤細(xì)胞增殖活性是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和前提,但侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)現(xiàn)還取決于腫瘤細(xì)胞對正常組織的破壞能力、腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力以及對侵襲轉(zhuǎn)移中所遭遇環(huán)境的適應(yīng)性等因素?；|(zhì)金屬

8、蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程幾乎可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分,在結(jié)腸癌的浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用,尤其是有基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetaUoproteinases-9,MMP-9)表達(dá)的結(jié)腸癌,其侵襲力更強(qiáng),預(yù)后更差。
　　 1998年RNAi的發(fā)現(xiàn),特別是在哺乳動物細(xì)胞應(yīng)用短發(fā)央RNA(smallinterfering RNA,siRNA)成功介導(dǎo)RNAi,為基因功

9、能的研究提供了強(qiáng)大的武器,也為結(jié)腸癌基因治療增添了新的活力,發(fā)現(xiàn)RNAi的科學(xué)家安德魯·法爾和克雷格·梅洛也因此獲得2006年醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。
　　 RNAi現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的體內(nèi)序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的基因沉默過程。其作用機(jī)制是dsRNA被核酸內(nèi)切酶Ⅲ樣蛋白加工成21～25個(gè)核苷酸組成的siRNA,siRNA與解旋酶、核酸酶及一些相關(guān)因子結(jié)合成RNA誘導(dǎo)

10、沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC在siRNA引導(dǎo)下,特異地切割與siRNA同源的靶mRNA,使其降解,細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型。由于RNAi對染色體DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生影響,具有特異性、高效性、對dsRNA長度依賴性和靶mRNA切割位點(diǎn)確定性等特點(diǎn),所以,迅速成為一種功能強(qiáng)大的、選擇性抑制特異基因表達(dá)的工具,也為腫瘤的基因治療提供了新方法。目前有體外化學(xué)合成、體

11、外轉(zhuǎn)錄(應(yīng)用T7啟動子)和應(yīng)用DNA載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄3種方式生成siRNA,其中DNA載體體內(nèi)轉(zhuǎn)錄方法是利用U6啟動子,構(gòu)建siRNA表達(dá)載體,在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)siRNA,能長期沉默真核細(xì)胞內(nèi)特定基因。RNAi技術(shù)可以針對信號通路的多個(gè)基因或者基因族的共有序列來同時(shí)抑制多個(gè)基因的表達(dá),從而能更有效地抑制腫瘤生長。目前已經(jīng)在病毒感染、腫瘤和遺傳性疾病中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),取得了良好的效果。現(xiàn)在,第一個(gè)RNAi藥物Bevasiranib(Acuit

12、yPharmaceuticals公司)已經(jīng)誕生。2004年FDA批準(zhǔn)Bevasiranib進(jìn)行臨床試驗(yàn)。2006年9月12日,公司公布Bevasiranibsodium(Cand5)的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果:Bevasiranib能夠減緩患者眼睛中血管的生長并改善視力。目前,FDA已經(jīng)批準(zhǔn)Bevasiranib進(jìn)入In期臨床實(shí)驗(yàn)。
　　 本研究構(gòu)建針對STAT3基因的shRNA表達(dá)載體,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞,利用RNA

13、i特異性沉默結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中STAT3,觀察RNA干擾STAT3后對結(jié)腸癌細(xì)胞生長、增殖及凋亡的影響；并觀察對MMP-9的表達(dá)的影響,研究其在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。為以STAT3為靶基因、以RNAi為方法的結(jié)腸癌基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株,提取質(zhì)粒,設(shè)計(jì)并構(gòu)建以STAT3為靶基因的短發(fā)夾狀小干擾RNA表達(dá)載體。探討STAT3短發(fā)夾RNA表達(dá)載體對人結(jié)腸癌HCT

14、116細(xì)胞增埴、凋亡和侵襲的影響。
　　 方法
　　 體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株,并根據(jù)NCBI提供的人類Stat3基因結(jié)構(gòu)(Gene ID:6774)和shRNA的設(shè)計(jì)原則,參考相關(guān)文獻(xiàn)選取特異性序列為干擾作用的靶點(diǎn),設(shè)計(jì)合成1個(gè)可干擾序列,并設(shè)計(jì)一條經(jīng)BLAST檢索與現(xiàn)有基因文庫中所有人源基因均無同源性的非特異性序列為陰性對照序列。采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞,粗提物離心除去內(nèi)毒素,然后選擇性地結(jié)合溶液中

15、的質(zhì)粒DNA,將雜質(zhì)和其它細(xì)藺成分去除,抽提純凈質(zhì)粒DNA。同時(shí)以pGPU6/GFP/STAT3質(zhì)粒為載體,構(gòu)建STAT3的短發(fā)央RNA表達(dá)載體,并對其進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。
　　 使用脂質(zhì)體法將STAT3的短發(fā)夾RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞系,轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為4組,空白對照組、短發(fā)夾RNA組、陰性對照組與脂質(zhì)體對照組共四組。抽提各組細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)行擴(kuò)增,并檢測pGPU6/GFP

16、/STAT3轉(zhuǎn)染HCT116后STAT3mRNA表達(dá)改變,通過FTC-2000A檢測樣本Ct值；細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后應(yīng)用Western blot法檢測pGPU6/GFP/STAT3轉(zhuǎn)染HCT116后STAT3蛋白表達(dá)改變并進(jìn)行比較；四氮唑藍(lán)比色還原法(MTT法)檢測pGPU6/GFP/STAT3 shRNA轉(zhuǎn)染HCT116后對其生長抑制效應(yīng)；轉(zhuǎn)染48小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測cyclinD1的表達(dá)量及時(shí)相,分析四組細(xì)胞周期分布與凋亡的變化。轉(zhuǎn)染細(xì)

17、胞分為4組,空白對照組、短發(fā)央RNA組、陰性對照組與脂質(zhì)體對照組共四組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用免疫組化法檢測四組MMP-9的蛋白表達(dá)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞愈合能力；Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行癌細(xì)胞體外侵襲力分析。
　　 結(jié)論
　　 本實(shí)驗(yàn)研究表明:①短發(fā)夾RNA可以特異性抑制HCT116的STAT3mRNA表達(dá),且效果顯著；②通過特異性沉默STAT3基因表達(dá),可以有效地抑制癌細(xì)胞增殖；③同時(shí)可使結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0.G