ART1對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制探討.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:探討精氨酸特異性腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶1(Arginine-specific ADP ribosyltransferase-1,ART1)基因表達(dá)對(duì)小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響和相關(guān)機(jī)制。
   方法:細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)ART1水平,以證實(shí)CT26細(xì)胞中有ART1的表達(dá)。以 ART1-shRNA、NC-shRNA(Negativecontrol-shRNA,NC-shRNA)、ART1過(guò)表達(dá)三種慢病毒顆粒感染CT

2、26細(xì)胞,以NC-shRNA組和未轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照組。采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)四組細(xì)胞ART1 mRNA和ART1蛋白的表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光法觀察四組細(xì)胞中ART1表達(dá)的差異;CCK-8(cell countingkit-8)法分析各組細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)觀察各組細(xì)胞周期分布。構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型,觀察各組移植瘤的生長(zhǎng)狀況(體積、重量)和小鼠存活時(shí)間,Western blot檢測(cè)移植瘤組織中ART1蛋白表達(dá)水平

3、的變化。Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞及移植瘤組織中RhoA和下游因子c-myc、c-fos及COX-2蛋白的表達(dá)。
   結(jié)果:
   1.CT26細(xì)胞中有ART1的表達(dá)。
   2.三種慢病毒成功感染細(xì)胞,獲得穩(wěn)定的相應(yīng)CT26細(xì)胞株。
   3.RT-PCR和western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在ART1-shRNA組CT26細(xì)胞中,ART1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0

4、.05),而在ART1過(guò)表達(dá)組CT26細(xì)胞中顯著增高(P<0.05),NC-shRNA組和未感染組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。
   4.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,ART1在ART1-shRNA組的CT26細(xì)胞中幾乎無(wú)表達(dá),其平均熒光強(qiáng)度值(17.35±2.01)顯著小于對(duì)照組(P<0.05),在ART1過(guò)表達(dá)組中有強(qiáng)烈的表達(dá)且高于對(duì)照組(61.41±3.51)(P<0.05)。
   5.CCK8法結(jié)果顯示, ART1-

5、shRNA組中CT26細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于對(duì)照組(P<0.05),ART1過(guò)表達(dá)組CT26細(xì)胞增殖抑制率顯著低于未感染組(P<0.05)。
   6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比較,ART1-shRNA組CT26細(xì)胞分裂各個(gè)時(shí)期細(xì)胞百分率產(chǎn)生了顯著的變化,G2期和S期明顯降低、細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低(P<0.05); ART1過(guò)表達(dá)組CT26細(xì)胞則相反,G2期和S期顯著增高、細(xì)胞增殖指數(shù)顯著增高(P<0.05)。
  

6、 7.在動(dòng)物皮下移植瘤模型中,各組移植瘤的生長(zhǎng)狀況顯示,與對(duì)照組移植瘤的體積和重量數(shù)據(jù)相比較,ART1-shRNA組明顯減小(P<0.05),ART1過(guò)表達(dá)組明顯增大(P<0.05);荷瘤小鼠存活狀況結(jié)果表明,ART1-shRNA組小鼠平均存活時(shí)間較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.05),ART1過(guò)表達(dá)組明顯縮短(P<0.05)。
   8.移植瘤組織進(jìn)行western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組中ART1蛋白的表達(dá)比較,ART1-

7、shRNA組中的表達(dá)明顯降低(P<0.05),ART1過(guò)表達(dá)組明顯升高(P<0.05)。各組細(xì)胞和移植瘤組織中RhoA、c-myc、c-fos和COX-2蛋白的western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,ART1-shRNA組各因子的表達(dá)明顯降低(P<0.05),ART1過(guò)表達(dá)組明顯升高(P<0.05)。
   結(jié)論:干擾和促進(jìn)ART1表達(dá)分別可以抑制和促進(jìn)CT26細(xì)胞增殖,提示ART1在腫瘤生長(zhǎng)增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其機(jī)制可能與改

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