旋覆花總黃酮抑制血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和新生內(nèi)膜形成的分子機(jī)制.pdf

1、當(dāng)血管內(nèi)皮損傷時(shí)，局部募集的炎性細(xì)胞可產(chǎn)生大量的活性氧分子（ROS），而ROS又可作為刺激因素，進(jìn)一步激活血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的遷移、增殖、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等一系列病理事件，導(dǎo)致血管內(nèi)膜發(fā)生肥厚和硬化等病變。因此，尋找新的有效藥物，抑制損傷誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激反應(yīng)以及由此引發(fā)的心血管疾病己成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。
　　 黃酮類化合物（flavonoids）是自然界中廣泛存在的一類酚類物質(zhì)，是藥用植物中的主要活性成分。流行

2、病學(xué)研究表明，F(xiàn)lavonoids具有抗炎、抗氧化、抗凝血等生理活性，適量攝取可以降低心血管疾病的發(fā)生概率。
　　 歐亞旋覆花（Inula britannica L.）是菊科（compositae）、旋覆花屬多年野生草本植物，性味咸、溫；入肺、腎經(jīng)。旋覆花總黃酮（TFE）是旋覆花中含量最多的一類活性成分，其含量約占旋覆花干重的10.9％，主要成分包括槲皮素、木犀草素、蘆丁、槲皮苷和異槲皮苷等。其在心血管系統(tǒng)中的抗氧化功效未見報(bào)道

3、。本研究觀察TFE對(duì)內(nèi)皮剝脫誘導(dǎo)的血管組織氧化應(yīng)激和新生內(nèi)膜形成的干預(yù)效應(yīng)，并在細(xì)胞和分子水平上探討其作用機(jī)制，旨在挖掘TFE在防治心血管疾病中的藥用價(jià)值。
　　 1.旋覆花總黃酮抑制損傷誘導(dǎo)的血管組織氧化應(yīng)激和新生內(nèi)膜形成研究證實(shí)，ROS是內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生的一個(gè)重要誘發(fā)因素，具有抗氧化作用的藥物均具有較好的抗血管硬化的臨床療效。TFE具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗衰老、抗腫瘤、降血脂等多種生理活性。然而，TFE對(duì)

4、損傷誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激和內(nèi)膜增生的干預(yù)效應(yīng)尚不清楚。本部分研究，以大鼠頸外動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈球囊剝脫內(nèi)膜增生模型為對(duì)象，觀察TFE對(duì)損傷誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激和內(nèi)膜增生的抑制效應(yīng)和相互關(guān)系。
　　 1.1球囊損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生
　　 形態(tài)學(xué)分析顯示，球囊剝脫內(nèi)皮3天后，血管損傷局部有大量血小板聚集，第7天時(shí)內(nèi)膜出現(xiàn)增厚，14天時(shí)增生達(dá)到峰值，可見血管內(nèi)膜向腔內(nèi)凸起，細(xì)胞增多且排列紊亂，內(nèi)膜呈現(xiàn)彌散性增厚。形態(tài)測(cè)量學(xué)分析顯示，術(shù)

5、后第7天，I/M比值開始升高；14天時(shí)，I/M比值較對(duì)照組增加50倍左右。表明本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的球囊剝脫內(nèi)膜增生模型是成功的。
　　 1.2 TFE劑量依賴性抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生
　　 為了觀察TFE抗內(nèi)膜增生效應(yīng)，將制備的TFE乳液于術(shù)前3天至術(shù)后14天以不同劑量（12.5，25，50 mg/kg/d）灌服大鼠。結(jié)果顯示，無(wú)論是頸總動(dòng)脈還是腹主動(dòng)脈，給予高劑量（50 mg/kg/d）TFE組的血管內(nèi)膜增生程度較模型

6、組明顯減輕；抑制效應(yīng)與陽(yáng)性對(duì)照藥物阿托伐他?。ˋTO）相似，兩組動(dòng)物的血管腔內(nèi)徑比模型組均明顯擴(kuò)大，而中、低劑量TFE的抗內(nèi)膜增生效應(yīng)不明顯。
　　 1.3 TFE抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激
　　 提示該藥物可提高血管組織的抗氧化能力。
　　 1.4 TFE降低大鼠血管組織中超氧陰離子（O2-）的含量
　　 血管組織O2-的生成量變化與內(nèi)膜增生程度具有正相關(guān)關(guān)系。
　　 1.5 TFE上調(diào)血管

7、組織中SOD蛋白的表達(dá)
　　 Western blot分析和免疫組化染色結(jié)果顯示，從假手術(shù)組的血管組織中可檢測(cè)到較高水平的SOD蛋白；而球囊損傷14天后，血管中SOD含量明顯降低，約為對(duì)照組的60％左右；給予TFE干預(yù)后，血管中的SOD含量有所增加，接近對(duì)照組水平，尤其在新生內(nèi)膜的管腔側(cè)，可見大量的SOD陽(yáng)性染色顆粒。
　　 1.6 TFE抑制球囊剝脫誘導(dǎo)的VSMC的表型轉(zhuǎn)化
　　 對(duì)分化型VSMC標(biāo)志基因SM2

8、2α的Western blot分析顯示，球囊損傷不同時(shí)間后，SM22α表達(dá)量呈進(jìn)行性下降，表明VSMC由分化型向去分化型轉(zhuǎn)化；給予TFE干預(yù)治療后，損傷誘導(dǎo)的SM22α表達(dá)活性降低受到明顯抑制，表明該藥物可抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化。
　　 2.旋覆花總黃酮體外抑制血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激
　　 在動(dòng)物整體水平上證明TFE能夠抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生和氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探討TFE調(diào)制血管氧化應(yīng)激的作用機(jī)制，本部分以

9、H2O2為誘導(dǎo)劑，建立VSMC氧化應(yīng)激模型，給與TFE干預(yù)，同時(shí)以槲皮素（TFE的主要成分之一）為對(duì)照，比較觀察兩種制劑對(duì)VSMC氧化應(yīng)激的調(diào)制效應(yīng)。
　　 2.1 H2O2對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響
　　 MTT分析結(jié)果表明，低濃度的H2O2（100-400μmol/L）處理VSMC后，不影響細(xì)胞活力和生長(zhǎng)速度，高濃度的H2O2（>800μmol/L）具有明顯的細(xì)胞毒性作用。本研究采用200μmol/L H2O2的終濃度用于

10、后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.2不同劑量TFE和槲皮素對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響
　　 結(jié)果表明，TFE對(duì)細(xì)胞增殖的直接抑制效應(yīng)較弱。
　　 2.3 TFE抑制VSMC中O2-的生成
　　 DHE染色結(jié)果顯示，200μmol/L H2O2刺激VSMC24 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的亮度明顯增強(qiáng)，提示細(xì)胞內(nèi)O2-生成明顯增多。
　　 2.4 FFE抑制H2O2誘導(dǎo)的MDA生成
　　 表明TFE和

11、槲皮素均可抑制H2O2誘導(dǎo)的MDA的生成，二者具有相同的功效。
　　 2.5 FFE上調(diào)SOD活性
　　 表明TFE和槲皮素均可以部分逆轉(zhuǎn)H2O2導(dǎo)致的SOD活性降低。
　　 3.旋覆花總黃酮抑制血管平滑肌細(xì)胞p47phox表達(dá)和磷酸化
　　 p47phox的表達(dá)活性、磷酸化水平和膜轉(zhuǎn)位速率的變化，均可直接影響細(xì)胞ROS的生成。
　　 本研究部分在已經(jīng)確證TFE具有抑制血管ROS生成，加快O2-清

12、除的基礎(chǔ)上，以p47phox為切入點(diǎn)，對(duì)TFE減少ROS產(chǎn)生的上游機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　 3.1 H2O2誘導(dǎo)VSMC中p47Phox的表達(dá)
　　 結(jié)果提示，H2O2對(duì)p47phox表達(dá)的誘導(dǎo)效應(yīng)具有濃度和時(shí)間依賴性。
　　 3.2 TFE抑制內(nèi)皮損傷誘導(dǎo)的血管p47phox的表達(dá)
　　 免疫組化結(jié)果顯示，球囊剝脫內(nèi)皮14天后的血管新生內(nèi)膜中，可見有大量p47phox陽(yáng)性染色的VSMC，彌散性分布于新生內(nèi)

13、膜區(qū)：而給予TFE藥物的血管，其新生內(nèi)膜肥厚程度減輕的同時(shí)，p47phox陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)也大大減少。Western blot分析得到了相似的結(jié)果，在球囊損傷3天時(shí)，p47Phox水平開始升高，約為對(duì)照組的1.9倍；到第14天時(shí)達(dá)到高峰，約為對(duì)照組的4倍左右；預(yù)先給予TFE藥物干預(yù)組，其損傷誘導(dǎo)的p47phox的表達(dá)上升被部分抑制，與14天的模型組相比降低50％以上。
　　 3.3 TFE和槲皮素抑制H2O2誘導(dǎo)的VSMC中p47p

14、hox的表達(dá)
　　 為了在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證TFE對(duì)p47phox似表達(dá)的抑制效應(yīng)，用TFE處理VSMC，以槲皮素作為陽(yáng)性對(duì)照。表明TFE和槲皮素可抑制H2O2誘導(dǎo)的VSMC中p47phox的基因轉(zhuǎn)錄。
　　 3.4 FFE和槲皮素抑制H2O2誘導(dǎo)的p47phox的磷酸化
　　 免疫沉淀分析結(jié)果顯示，對(duì)照組VSMC中，p47phox的磷酸化水平相對(duì)較低，H2O2刺激VSMC15 min、30 min、1 h后，

15、p47phox磷酸化水平快速、短暫升高，于刺激15 min時(shí)即達(dá)高峰，隨后略有降低，但仍高于正常水平。
　　 4.旋覆花總黃酮對(duì)ERK1/2、AKT和NF-κB信號(hào)通道的調(diào)制作用
　　 血管內(nèi)皮損傷局部募集的炎性細(xì)胞除釋放多種致炎因子外，還可產(chǎn)生大量的ROS，后者可通過(guò)影響胞內(nèi)信號(hào)分子的磷酸化修飾，而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。細(xì)胞內(nèi)有多條信號(hào)通路參與介導(dǎo)ROS誘導(dǎo)的p47Phox磷酸化過(guò)程。
　　 4.1 FFE和槲

16、皮素抑制內(nèi)皮損傷和H2O2誘導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化
　　 免疫組化和Western blot分析檢測(cè)了TFE和槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化的影響，結(jié)果顯示，球囊剝脫損傷14天后，模型組大鼠血管新生內(nèi)膜VSMC中有大量磷酸化ERK1/2陽(yáng)性染色顆粒；而給藥組大鼠新生內(nèi)膜肥厚程度減輕的同時(shí)，血管組織中磷酸化ERK1/2陽(yáng)性顆粒數(shù)量明顯減少。
　　 4.2 TFE和槲皮素抑制H2O2誘導(dǎo)的Akt的磷酸化
　

17、　 Western blot結(jié)果顯示，不同條件處理的VSMC，其總Akt表達(dá)量基本一致，但磷酸化Akt的水平存在明顯差異。
　　 4.3 TFE和槲皮素能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位
　　 結(jié)果表明，TFE和槲皮素可不同程度地抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位，而槲皮素單體具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.FFE通過(guò)上調(diào)總SOD蛋白表達(dá)和活性、促進(jìn)O2-的清除

18、，降低球囊損傷誘導(dǎo)的血管氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制血管新生內(nèi)膜形成和由此導(dǎo)致的血管狹窄。
　　 2.TFE可以部分逆轉(zhuǎn)H2O2導(dǎo)致的SOD活性降低、降低MDA水平、促進(jìn)O2-的清除，從而抑制VSMC氧化應(yīng)激。
　　 3.TFE可抑制p47phox基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)及磷酸化活化，該效應(yīng)是TFE減少ROS生成和抑制氧化應(yīng)激的分子機(jī)制之一。
　　 4.TFE對(duì)ROS誘導(dǎo)的ERK1/2、Akt和NF-κB信號(hào)通路的激活具有不同