旋覆花倍半萜內酯類萬分與TNF-α的相互作用及其抗炎活性研究.pdf

1、[研究背景]:
　　 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種具有較強促炎活性和免疫調節(jié)作用的重要細胞因子，通過與兩種特異性細胞膜受體的相互作用發(fā)揮其生物學功能。Ⅰ型受體(TNFR1)主要介導TNF-α的促炎活性和細胞毒活性，而Ⅱ型受體（TNFR2）則更多地參與TNF-α的免疫調控和抗感染活性。直接抑制TNF-α活性的生物制劑如抗TNF-α抗體在多種炎癥疾病的治療中取得了重大進展，表明細胞外阻斷這種促炎細胞因子是一種有效的治療手段，

2、而目前臨床上使用的TNF-α拮抗劑同時抑制TNFR1和TNFR2介導的信號，因此，長期使用TNF-α拮抗劑會導致患者抗感染能力下降等嚴重的副作用。
　　 從傳統(tǒng)中藥中發(fā)現有活性的天然先導化合物已經成為新藥研發(fā)的重要途徑之一，目前已經發(fā)現多種可以抑制TNF-α表達或阻斷其活性的天然小分子化合物并用于炎癥疾病的治療，這些小分子藥物可能成為生物制劑的替代品。然而，迄今已發(fā)現的大多數小分子TNF-α拮抗劑局限于機制不明的TNF-α表達抑

3、制劑、基于細胞水平分析的機制不明的TNF-α活性抑制劑以及各種與TNF-α表達和活性相關的細胞內信號通路抑制劑，而能夠直接抑制TNF-α與其受體相互作用的小分子TNF-α拮抗劑卻鮮有報道。
　　 本課題組在前期研究中發(fā)現一種從藥用植物旋覆花中分離鑒定的倍半萜內酯二聚體XFH-31可能是新型的TNF-α拮抗劑，Biacore分析表明其能與TNF-α直接結合，ELISA和細胞學實驗證明XFH-31能抑制TNF-α與TNFR1的相互作

4、用，并阻斷TNFR1介導的促炎活性?；诖?，本研究繼續(xù)對XFH-31和從旋覆花同一活性部位分離得到的XFH-31的結構類似物展開研究。
　　 [研究目的]:
　　 從旋覆花的倍半萜內酯類成分中發(fā)現一類以TNF-α為明確作用靶點的新型抗炎候選藥物，為進一步的結構優(yōu)化、分子設計和新型的TNF-α小分子拮抗劑研發(fā)奠定基礎。
　　 [研究方法]:
　　 1、Biacore技術分析化合物與TNF-α的直接相互作用;

5、
　　 2、凝膠過濾、非變性凝膠電泳、圓二色譜法分析XFH-31對TNF-α立體構象的影響;
　　 3、ELISA法分析TNF-α與其受體的相互作用，細胞實驗檢測125I標記的TNF-α與L929細胞的特異性結合量，分析化合物對125I標記的TNF-α與L929細胞表面的TNF-α受體結合的影響;
　　 4、MTT法分析TNF-α介導的L929細胞毒活性;
　　 5、雙熒光素酶報告基因法和Western

6、blot法檢測TNF-α刺激的293細胞和bEnd.3小鼠血管內皮細胞的NF-κB通路的活化;
　　 6、Real-time PCR法分析TNF-α刺激的bEnd.3小鼠血管內皮細胞趨化因子和粘附分子的表達;
　　 7、D-GalN/TNF-α聯合誘導的小鼠急性肝損傷模型評價XFH-31的體內抗炎作用。
　　 [研究結果]:
　　 1、XFH-31可與TNF-α直接結合，選擇性地抑制TNF-α與TNFR1

7、的相互作用，阻斷TNFR1介導的信號，在體內和體外拮抗TNF-α的促炎活性。
　　 (1) Biacore分析結果再次確認XFH-31可與TNF-α直接結合，KD=7.02μM;
　　 (2)凝膠過濾和非變性凝膠電泳表明XFH-31不會導致TNF-α三聚體解聚，但是TNF-α與系列濃度的XFH-31孵育后進行非變性凝膠電泳，發(fā)現TNF-α三聚體的主帶明顯變寬，提示XFH-31與TNF-α的結合可能會引起TNF-α的構象變

8、化。XFH-31的存在使TNF-α的圓二色譜發(fā)生微小但明顯可見的變化，這一結果確認了XFH-31可使TNF-α的二級結構發(fā)生細微的變化;
　　 (3) XFH-31在2.5-10μM濃度內能以劑量依賴的方式抑制TNF-α與TNFR1的結合，而對TNF-α與TNFR2的結合僅具有較弱的抑制作用;
　　 (4) XFH-31在2.5-10μM濃度內能以劑量依賴的方式抑制TNF-α殺傷L929細胞的活性和125I標記的TNF-

9、α與L929細胞膜受體的結合;
　　 (5)雙熒光素酶報告基因法的檢測結果發(fā)現XFH-31在2.5-10μM劑量范圍內能以劑量依賴的方式抑制TNF-α刺激的293細胞內NF-κB報告基因的表達，但對IL-1刺激的NF-κB報告基因的表達基本無影響;Western blot結果進一步表明XFH-31能劑量依賴性地抑制TNF-α刺激所引起的IκBα磷酸化和降解，但對IL-1刺激所引起的IκBα磷酸化和降解則無顯著影響;
　　

10、 (6) XFH-31在2.5-10μM劑量范圍內能以劑量依賴的方式抑制TNF-α刺激的bEnd.3小鼠血管內皮細胞MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的表達，阻斷TNF-α活化的NF-κB和MAPKs(p38，JNK和ERK)信號通路;
　　 (7)在D-GalN/TNF-α聯合誘導的小鼠急性肝損傷模型中，與模型組比較，XFH-31治療組（8 mg/kg，i.p.）小鼠死亡率和血清ALT水平明顯降低，肝細胞凋亡明顯減少，肝組

11、織內趨化因子MCP-1和MCP-2及粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表達明顯降低，提示XFH-31通過有效地抑制TNFR1介導的肝毒和炎癥應答反應發(fā)揮其療效，減輕TNF-α聯合D-GaLN誘導的急性肝損傷。
　　 2、多種旋覆花來源的XFH-31的結構類似物能與TNF-α直接結合，選擇性地抑制TNF-α與TNFR1的相互作用，并在體外拮抗TNF-α的細胞毒活性。
　　 (1)從37個旋覆花來源的倍半萜內酯中篩選出13

12、個能有效抑制TNF-α殺傷L929細胞的活性，同時單獨對L929細胞的存活或增殖無直接影響;
　　 (2)上述13個倍半萜內酯中有10個化合物（XFH-31、TX-79、TX-109、XY-32、TX-69、XY-56、TX-65、TX-91、XY-34和XY-48）可以有效抑制TNF-α與TNFR1的相互作用，其中6個化合物對TNF-α與TNFR1結合的抑制活性明顯比其對TNF-α與TNFR2結合的抑制活性強;
　　

13、(3)進一步的Biacore分析發(fā)現6個倍半萜內酯(TX-79、TX-91、TX-109、XY-15、XY-27和XY-32)可與TNF-α直接結合，其中5個是倍半萜內酯二聚體。
　　 [結論]:
　　 從旋覆花中分離得到的新的倍半萜內酯二聚體XFH-31可與TNF-α直接結合，選擇性地抑制TNF-α與TNFR1的相互作用，在TNF-α刺激的細胞中有效地阻斷TNFR1介導的信號，在體內和體外拮抗TNF-α的促炎活性。其他