骨髓間質(zhì)細胞與TNF-α損傷的PC12細胞之間相互作用及其相關(guān)機制的實驗研究.pdf

1、目的:
　　神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一種以神經(jīng)元退行性病變?yōu)榛A(chǔ)的慢性進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，雖然誘發(fā)此類疾病的病因和病變部位不盡相同，但不可忽視的是，腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與神經(jīng)退行性疾病有著密不可分的聯(lián)系。神經(jīng)退行性疾病的共同特征是特定區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元功能的喪失，即神經(jīng)元不可逆的損傷、死亡。目前的藥物治療和外科手術(shù)均不能從根本上解決這一問題，隨著細胞代替療法的逐步發(fā)展，能否通過細胞移植來恢復神經(jīng)通路

2、中的神經(jīng)元功能以治療神經(jīng)退行性病變，成為醫(yī)療界關(guān)注及研究的焦點。骨髓基質(zhì)細胞(Bone marrow stromalcells，BMSCs)是來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，其移植后可修復神經(jīng)元變性引起的神經(jīng)傳導通路損傷或者補充新的神經(jīng)元。移植的干細胞能夠起到治療作用，很可能是這些未分化的細胞創(chuàng)造了一個適于細胞存活的環(huán)境，使這個微環(huán)境具有有利于病變組織細胞存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子和/或神經(jīng)生長因子，從而增強神經(jīng)發(fā)生和促進

3、病變組織神經(jīng)細胞自身修復的進程。本研究采用PC12細胞株模擬神經(jīng)細胞，以TNF-α刺激PC12細胞模擬神經(jīng)系統(tǒng)病變發(fā)生凋亡的神經(jīng)細胞，以轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)方法模擬共育體系培養(yǎng)PC12和BMSCs，研究共育微環(huán)境中BMSCs能否為TNF-α刺激PC12細胞提供保護作用，減少PC12細胞凋亡，促進PC12細胞自身修復;共育微環(huán)境中BMSCs是否通過分泌細胞因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子來提供保護、促進受損PC12細胞修復;以及BMSCs分泌細胞因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子

4、的量是否與其所處的細胞微環(huán)境有關(guān)。
　　材料與方法:
　　一、BMSCs培養(yǎng)及鑒定
　　二、實驗模型
　　1、PC12細胞凋亡模型
　　以不同濃度(6.25、12.5、25、50、100、200、400 ng/ml)的TNF-α溶液作用于PC12。
　　2、共育微環(huán)境模型
　　以轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)方法將PC12和BMSCs共育培養(yǎng)。
　　三、BMSCs對TNF-α損傷PC12的保護作用
　　1

5、、實驗分組
　　(1)陰性對照組:正常培養(yǎng)的PC12細胞。
　　(2)陽性對照組:TNF-α處理PC12細胞2h后，棄去TNF-α，加入新鮮無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。
　　(3)共育培養(yǎng)組:將PC12與BMSCs共育培養(yǎng)，同時加入TNF-α處理2h后，棄去TNF-α，加入新鮮無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。
　　(4)單向作用組:TNF-α處理BMSCs2 h后，棄去TNF-α，加入新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取該

6、培養(yǎng)液上清培養(yǎng)TNF-α處理2h的PC12細胞24 h。
　　(5)雙向作用組:以TNF-α處理PC12細胞2h后，棄去TNF-α，加入新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取該上清培養(yǎng)TNF-α處理2h的BMSCs24 h，取該培養(yǎng)液上清培養(yǎng)損傷PC12細胞24 h。
　　2、指標檢測
　　(1) MTT法檢測各組的PC12細胞凋亡率。
　　(2)電鏡觀察各組PC12細胞處理后超微結(jié)構(gòu)變化。
　　(3) real

7、time-PCR法檢測PC12細胞表面TNF-R1、TNF-R2 mRNA表達變化。
　　(4) Western Blot法測定PC12細胞caspase-8蛋白表達情況。
　　(5) ELISA法測定PC12細胞中NF-κB p65變化。
　　四、PC12對BMSCs功能的影響
　　1、實驗分組
　　(1)對照組:以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)正常的BMSCs細胞。
　　(2) TNF-α組:50 ng/ml的

8、TNF-α處理BMSCs細胞2h后，棄去TNF-α，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　(3)共育組:將PC12與BMSCs共育培養(yǎng)，同時加入TNF-α處理2h后，棄去TNF-α，加入新鮮無血清培養(yǎng)基。
　　(4)條件培養(yǎng)液組:TNF-α處理PC12細胞2h后，棄去TNF-α，加入新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，取該培養(yǎng)基上清培養(yǎng)BMSCs細胞。
　　以上述各組作為平行對照。在同等條件下，先向BMSCs中加入NF-κB、JNK和

9、ERK的抑制劑作用3h，再進行各組的相應處理。
　　2、指標檢測
　　ELISA法檢測不同條件培養(yǎng)的BMSCs培養(yǎng)液上清中GDNF、VEGF的含量。
　　五、統(tǒng)計學處理
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進行分析，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　一、BMSCs鑒定結(jié)果
　　BMSCs表現(xiàn)為梭型及類成纖維細胞樣，細胞形態(tài)均

10、一。通過免疫熒光檢測顯示，BMSCs表面抗原CD45表達為陰性，說明非造血干細胞;CD44表達為陽性，說明為間充質(zhì)干細胞類。
　　二、不同濃度TNF-α對PC12細胞的影響
　　細胞凋亡率隨著TNF-α劑量增加而增加，并呈劑量-效應關(guān)系。其中50 ng/ml劑量時細胞存活率為53.40％，細胞凋亡率為40.74％。
　　三、BMSCs對TNF-α損傷PC12的保護作用
　　1、凋亡檢測
　　共育培養(yǎng)組、單向

11、作用組、雙向作用組PC12細胞存活率與陽性對照組相比明顯提高，凋亡率下降。單向作用組、雙向作用組PC12細胞存活率低于共育培養(yǎng)組，其中單向作用組差異較明顯(P＜0.05);雙向作用組細胞凋亡率高于共育培養(yǎng)組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。雙向作用組的細胞存活率高于單向作用組，但凋亡率低于單向作用組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、電鏡觀察
　　正常PC12細胞呈圓形，細胞膜表面微絨毛豐富，胞漿內(nèi)見粗面內(nèi)質(zhì)

12、網(wǎng)，線粒體及糖原顆粒，細胞核巨大，核切跡明顯，有兩個以上的核仁，細胞核以常染色質(zhì)為主。陽性對照組:細胞膜內(nèi)陷，細胞質(zhì)空泡化，細胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)濃集、邊集化。共育培養(yǎng)組:受損細胞呈圓形，細胞膜微絨毛數(shù)量減少，胞漿內(nèi)細胞器減少，但形態(tài)正常，可見線粒體數(shù)量明顯減少，可見大量脂滴。核漿比例變小，有一個核仁，以常染色質(zhì)為主。單向作用組:細胞膜微絨毛明顯減少，核切跡明顯，染色質(zhì)濃縮。雙向作用組:細胞呈橢圓形，細胞膜微絨毛減少，核內(nèi)染色質(zhì)有凝聚

13、凝集現(xiàn)象，部分邊集于核膜下。
　　3、Realtime-PCR結(jié)果
　　陽性對照組和單向作用組的TNFR1 mRNA表達明顯上調(diào)，共育培養(yǎng)組和雙向作用組變化并不顯著;TNFR2 mRNA表達變化最大的為共育培養(yǎng)組和雙向作用組，而陽性對照組及單向作用組變化并不明顯。
　　4、Western blot結(jié)果
　　陽性對照組和單向作用組Caspase-8的裂解產(chǎn)物p26蛋白表達量較其余組明顯上調(diào)，其中陽性對照組的proc

14、aspase-8表達量亦有明顯增加(P＜0.05)。共育培養(yǎng)組和雙向作用組PC12 procaspase-8及其裂解產(chǎn)物p26蛋白表達均低于陽性對照組(P＜0.05)。
　　5、ELISA結(jié)果
　　與陰性對照組比較，NF-κB p65在陽性對照組中濃度略有升高(P＞0.05)，而共育培養(yǎng)組、單向作用組和雙向作用組NF-κB p65濃度則明顯升高(P＜0.05)。共育培養(yǎng)組和雙向作用組NF-κB p65濃度與單向作用組比較，差

15、異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　四、PC12對BMSCs功能的影響
　　隨著培養(yǎng)時間延長，對照組BMSCs在最初24 h分泌因子的量最高，之后則逐漸減少(P＜0.05)。其他組BMSCs分泌2種因子的量均高于對照組。共育組BMSCs各時段分泌2種細胞因子的量最高，不同時點測定的GDNF分別為（200.54±45.98）、（115.19±24.61）、（98.60±15.01）pg/ml;不同時點測定的VEGF分別為（9

16、19.26±98.63）、（581.54±68.54）、（560.53±79.57）pg/ml。與對照組相比，共育組0～24 h、24～72 h、72～168 h分泌的GDNF、VEGF均有提高，且差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　對照組BMSCs在加入NF-κB抑制劑后各時間段分泌GDNF、VEGF量與未加入時無明顯差異，TNF-α組、共育組、條件培養(yǎng)液組的BMSCs在加入NF-κB抑制劑后各時間段分泌GDNF、VEGF量與

17、各自未加入的相應時間段相比均有所下降，尤其是在24～72 h和72～168 h時段BMSCs分泌GDNF、VEGF的量明顯低于相應未加入抑制劑的平行對照(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　本研究將細胞分為共育培養(yǎng)組、單向作用組、雙向作用組，共育培養(yǎng)組為兩種細胞同時接受TNF-α的處理后共同培養(yǎng);單向作用組為以TNF-α處理后的BMSCs培養(yǎng)液上清培養(yǎng)損傷的PC12細胞;雙向作用組則以TNF-α處理的PC12細胞培養(yǎng)液上清培養(yǎng)

18、BMSCs后，再用該上清反作用于損傷PC12細胞，目的是為了證實PC12細胞在受到損傷后能否在共育體系中發(fā)揮作用，最終利于自身的修復。通過細胞存活率和細胞凋亡率可以觀察到，共育培養(yǎng)組細胞存活率較陽性對照組明顯提高，凋亡率明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明在共育體系中，BMSCs能夠通過非接觸方式抑制PC12細胞凋亡，提高PC12細胞存活率，促進PC12細胞修復。
　　本實驗中，陽性對照組PC12細胞TNFR1表達

19、增加，并且產(chǎn)量最高，Caspase-8表達增加，說明PC12細胞通過TNFR1-TRADD-FADD途徑誘導凋亡。另外，TNFR1還可以通過TNFR1-TRADD-TRAF途徑激活NF-κB，進而抑制細胞凋亡和促進炎癥反應;TNFR2也可以與TRAF結(jié)合形成復合體激活NF-κB，誘導基因轉(zhuǎn)錄，促進細胞存活、增殖和分化。但是在陽性對照組中，NF-κB盡管也呈陽性表達，但是其抑制凋亡的作用遠不如活化的Caspase-8誘導凋亡作用明顯。共育

20、培養(yǎng)組和雙向作用組PC12細胞TNFR1 mRNA表達較陰性對照組略有升高，Caspase-8表達高于陰性對照組，低于陽性對照組，說明共育培養(yǎng)組和雙向作用組PC12細胞在BMSCs的干預下，TNFR1表達、Caspase-8表達均有所下降，而TNFR2與NF-κB的表達增加，這也是共育培養(yǎng)組和雙向作用組凋亡率明顯降低的原因。另外，共育培養(yǎng)組和雙向作用組PC12細胞TNFR2表達提高，NF-κB活性增強，推測可能是由于BMSCs通過向培養(yǎng)

21、液上清中釋放具有保護作用的細胞因子，從而激活NF-κB，抑制TNFR1招募Caspase-8，抑制了PC12細胞凋亡，提高了PC12細胞的存活率，促進了PC12細胞的自身修復。故本實驗證實了關(guān)于BMSCs治療機制中的“細胞伙伴”觀點，即移植的干細胞能夠起到治療作用，其為已發(fā)生凋亡或處于前凋亡狀態(tài)的PC12細胞提供了一個適于存活/修復的環(huán)境，使這個微環(huán)境具有有利于PC12細胞存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子和（或）神經(jīng)生長因子，從而抑制PC12細胞的凋

22、亡、促進其自身修復的進程。
　　BMSCs在正常培養(yǎng)情況下即可分泌GDNF、VEGF等細胞因子。BMSCs在受到TNF-α刺激后，細胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子等的分泌量提高，但是分泌速度隨著培養(yǎng)時間的延長而降低?，F(xiàn)階段對于BMSCs功能的研究仍無法闡述神經(jīng)系統(tǒng)中的損傷微環(huán)境誘導BMSCs釋放這些生長因子的機制。本研究采用TNF-α模擬神經(jīng)系統(tǒng)中的損傷因素作用于BMSCs，其損傷機制為:TNF-α與TNFR1結(jié)合后，可誘導TRADD、RI

23、P、TRAF2形成復合物，并最終激活NF-κB信號通路以及包括p38、ERK、JNK的MAPK通路，進而影響細胞的增殖、凋亡、分化過程。在此凋亡通路中，NF-κB具有重要調(diào)節(jié)作用。NF-κB可以通過調(diào)控多種凋亡相關(guān)基因的表達引起神經(jīng)細胞的損傷和保護。NF-κB通路在干細胞的增殖、遷移和分化中亦起重要作用。本實驗中，在加入NF-κB抑制劑(PDTC)后，GDNF、VEGF2種因子的分泌量大幅下降，而加入ERK抑制劑與JNK抑制劑后，GDN

24、F、VEGF2種因子的量無明顯變化，說明BMSCs在50 ng/ml的TNF-α的刺激下，經(jīng)由NF-κB途徑釋放GDNF、VEGF;釋放GDNF、VEGF的機制與ERK、JNK途徑無關(guān)，由此推測該機制應與p38 MAPK途徑有重要關(guān)系。
　　共育組BMSCs功能較對照組和TNF-α組均有明顯提高;損傷PC12細胞條件培養(yǎng)液可以提高GDNF、VEGF的分泌量，但提高幅度不如共育組明顯。此結(jié)果提示，損傷的PC12細胞可能通過向培養(yǎng)液上