人肝臟特異性表達的小RNA——miR-122表達調(diào)控機制與功能的研究.pdf

1、microRNA（miRNA）是與轉錄后基因沉默相關的一類長度為21-23nt的重要RNA，最早在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)已證實，miRNA廣泛存在于真核生物細胞內(nèi)，是最大的基因家族之一，約占整個基因組的1％-4％。最近研究表明，miRNA功能廣泛，在生物體內(nèi)的多種生物學過程和調(diào)控途徑中扮演著關鍵性角色，如發(fā)育進程控制、細胞生長與凋亡、細胞分裂、細胞分化與器官發(fā)育、病毒感染、維持機體生理活動

2、的動態(tài)平衡等。它們通過依賴于miRNA和靶基因的互補性的兩種不同的機制反向調(diào)控靶基因的表達。當miRNAs和編碼蛋白質的mRNA幾乎完全配對時，miRNAs誘導RNA介導（RNAi）的干擾途徑；當這些miRNAs通過不完全的堿基配對和mRNA的3’非翻譯區(qū)（UTRs），在一個類似于或者可能是等同于RNA干擾途徑中使用的RISC復合物中，在轉錄后水平上抑制基因翻譯。迄今為止，miRNA的研究工作主要集中在三個方向：1）miRNA的克隆和鑒

3、定；2）miRNA的功能研究；3）miRNA的表達調(diào)控。其中，miRNA的表達調(diào)控的研究近年來發(fā)展迅速，引起了廣泛關注。
　　 miR-122是一個肝臟特異性高表達的microRN。它除了在精子發(fā)生過程中有短暫低量表達以外，其他情況下都在肝臟保持著組織特異性的高表達。隨后的功能研究發(fā)現(xiàn)，miR-122主要參與了以下幾個方面的生物學事件：1）miR-122對于維持HCV的復制有重要作用；2）miR-122參與精子發(fā)生過程；3）mi

4、R-122參與脂類代謝過程；4）miR-122與肝癌發(fā)生有關。然而，對于miR-122如何實現(xiàn)肝臟特異性的高表達以及如何在脂類代謝過程中進行自身調(diào)節(jié)以保持脂類代謝的動態(tài)平衡我們還知之甚少。
　　 本研究以人miR-122為研究對象，探索miR-122肝臟特異性高表達及在脂類代謝過程中的表達調(diào)控機制。首先對人miR-122的基因組定位、進化保守性、前體可能的產(chǎn)生過程以及邊界進行了生物信息學的分析。然后，利用Northern blo

5、t、RT-PCR和RACE對miR-122前體pri-miR-122進行分析；利用染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）研究pri-miR-122的染色質開放狀態(tài)和轉錄機器；利用報告基因系統(tǒng)結合生物信息學分析以及序列刪除和突變技術確定pri-miR-122的啟動子區(qū)域以及可能結合的轉錄因子；利用逆轉錄病毒載體介導的基因過表達和RNA干擾（RNAi）技術驗證轉錄因子對miR-122的調(diào)

6、控作用。研究結果發(fā)現(xiàn)：人miR-122基因位于一個肝臟特異性表達的轉錄單元內(nèi)，是由一個較長的前體非編碼基因轉錄本通過剪切后而產(chǎn)生。這個前體轉錄本在進化上序列保守性不高，但其啟動子區(qū)具有相當高的保守性。miR-122前體轉錄本包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子，具有一個相當長的3’-UTR，而miR-122莖環(huán)結構就位于其中。miR-122前體基因啟動子區(qū)位于miR-122保守莖環(huán)序列上游約5kb處，包含多個核受體因子結合序列如DR順式元件和明顯

7、的RNA聚合酶Ⅱ所識別的啟動子順式元件如TATA-box和CCAAT-box等，利用報告基因系統(tǒng)結合生物信息學分析以及序列刪除和突變技術鑒定了這些元件對于miR-122基因表達具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。對上述元件進一步進行生物信息學分析，推測在該啟動子區(qū)可能存在多個與脂代謝相關的轉錄因子的結合位點，如HNF4、PPARα和FOXO家族等轉錄因子的結合位點。我們首先利用報告基因系統(tǒng)確定了HNF4對該啟動子具有明顯的正調(diào)控作用，當潛在的HNF

8、4結合位點被突變后，再進行報告系統(tǒng)進行檢測，HNF4的正調(diào)控作用明顯下降，與對照組沒有明顯差異。隨即我們利用染色質免疫共沉淀技術對Huh7細胞內(nèi)源HNF4富集的片段利用針對該啟動子的特異性引物進行擴增后發(fā)現(xiàn)，當在Huh7細胞內(nèi)過表達HNF4轉錄因子時，miR-122的前體與成熟序列的表達都發(fā)生了比較明顯的上調(diào)，而利用可以抑制HNF4表達的藥物PMA[8]對Huh7進行處理后，miR-122的表達發(fā)生了明顯的下調(diào)，說明HNF4對于miR-

9、122的正常表達具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。另外，我們利用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對miR-122的潛在靶基因進行了篩選。根據(jù)sanger研究所miRbase數(shù)據(jù)庫預測的數(shù)據(jù)，我們首先對miR-122的所有潛在靶基因進行了初步分析，其中與代謝相關的重要酶類占了相當大的比例。然后通過將表達miR-122的載體與在熒光素酶報告基因3’下游含有miR-122潛在靶基因的完整3’UTR區(qū)的載體共轉染293T細胞并設立嚴格的對照，驗證了miR-122