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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分應(yīng)用氧化比色微量稀釋藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)念珠菌對(duì)特比萘芬的敏感性
目的:了解本地區(qū)臨床分離念珠菌對(duì)特比萘芬的體外敏感性及耐藥狀況,為臨床合理用藥提供參考。
方法:參照美國(guó)國(guó)家臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的M27-A藥敏試驗(yàn)方案的微量稀釋法,并應(yīng)用氧化還原指示劑Alamar blue作為藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果指示劑,通過氧化比色法判定藥物的最小抑菌濃度(MIC),檢測(cè)特比萘芬對(duì)2株ATCC標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌和129株臨
2、床分離念珠菌的MIC值。
結(jié)果:特比萘芬對(duì)2株ATCC標(biāo)準(zhǔn)白念珠菌的MIC值分別為8μg/ml和2μg/ml;特比萘芬對(duì)129株臨床分離的念珠菌的MIC值范圍為0.0313~16μg/ml,MIC50為4μg/ml,MIC90為8μg/ml,其中,特比萘芬對(duì)白念珠菌的MIC值介于≤0.0313~≥16μg/ml之間,MIC50為4μg/ml。MIC90為8μg/ml;對(duì)熱帶念珠菌的MIC值介于2~≥16μg/ml之間,MIC5
3、0為8μg/ml,MIC90為16μg/ml;對(duì)季也蒙念珠菌的MIC值介于1~4μg/ml之間,MIC50為2μg/ml,MIC90為4μg/ml;對(duì)近平滑念珠菌的MIC值介于1~4μg/ml之間,MIC50為2μg/ml,MIC90為4μg/ml;對(duì)克柔念珠菌的MIC值介于0.5~4μg/ml之間;對(duì)葡萄牙念珠菌的MIC值介于4~≥16μg/ml之間。
結(jié)論:特比萘芬對(duì)本地區(qū)臨床流行的念珠菌有良好的體外抑菌作用,本地區(qū)目前尚
4、未發(fā)現(xiàn)耐特比萘芬的念珠菌流行;氧化比色微量稀釋藥敏試驗(yàn)方法有較好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性,且簡(jiǎn)單省時(shí)。
第二部分白念珠菌對(duì)特比萘芬耐藥性的體外梯級(jí)誘導(dǎo)和回復(fù)研究
目的:以濃度梯級(jí)倍增的特比萘芬在體外誘導(dǎo)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株獲得耐藥子代菌株,并觀察其耐藥穩(wěn)定性,從細(xì)胞水平研究白念珠菌對(duì)特比萘芬耐藥前后生物學(xué)特性的變化,為進(jìn)一步采用基因芯片在基因表達(dá)水平上研究特比萘芬對(duì)白念珠菌的藥理作用及其誘導(dǎo)耐藥機(jī)制提供理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?br>
5、 方法:將白念珠菌ATCC90028株在特比萘芬濃度逐漸梯級(jí)倍增的YPD液體培養(yǎng)基中分別轉(zhuǎn)種傳代,直到最后轉(zhuǎn)種至含1024μg/ml特比萘芬的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別測(cè)定誘導(dǎo)后形成的各子代菌株的MIC值;選用以1024μg/ml特比奈芬誘導(dǎo)形成的耐藥菌株,在不含特比萘芬的YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次后,測(cè)定其MIC值,觀察其耐藥表型的穩(wěn)定性;并分別用肉眼、光鏡和電鏡觀察白念珠菌耐藥性產(chǎn)生前后的形態(tài)學(xué)特征。
結(jié)果:特比萘
6、芬MIC值為8μg/ml的白念珠菌母本菌株(白念珠菌ATCC90028)成功地被誘導(dǎo)成特比萘芬MIC值為≥512μg/ml的子代菌株,進(jìn)一步的耐藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)說明誘導(dǎo)后形成的子代菌株的表型是相對(duì)穩(wěn)定的,誘導(dǎo)后的子代耐藥菌株與其母本相比,其生長(zhǎng)繁殖速度減慢,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,部分細(xì)胞胞膜不完整。
結(jié)論:通過在藥物濃度梯級(jí)倍增的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)的方法可成功建立相同基因型的對(duì)特比萘芬敏感的白念珠菌母本和對(duì)特比萘芬耐藥的子代模型,為獲
7、取有親本的耐藥白念珠菌菌株提供了一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)方法,是在基因水平研究白念珠菌對(duì)特比萘芬耐藥機(jī)制的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)P汀?br> 第三部分應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片研究特比萘芬處理前后白念珠菌基因的差異性表達(dá)
目的:應(yīng)用白念珠菌全基因組表達(dá)譜芯片比較特比萘芬處理前后白念珠菌基因的差異性表達(dá),分析特比萘芬處理對(duì)白念珠菌整個(gè)基因組表達(dá)譜的影響,以期在全基因組水平上研究特比萘芬對(duì)白念珠菌的抗真菌作用機(jī)制。
方法:用特比萘芬處理白念珠菌
8、 ATCC90028株90min,將處理后的菌株命名為白念珠菌ATCC90028-C株,應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片比較白念珠菌ATCC90028和ATCC90028-C株全基因組表達(dá)譜的差異,并應(yīng)用半定量 RT-PCR方法對(duì)白念珠菌 ATCC90028和ATCC90028-C株中部分差異表達(dá)基因的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)果:基因芯片共篩選出222個(gè)差異表達(dá)基因,與白念珠菌 ATCC90028株比較,在ATCC90028-C株中有12
9、1個(gè)基因表達(dá)上調(diào),有101個(gè)基因表達(dá)下調(diào),半定量RT-PCR與全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果一致,表達(dá)上調(diào)基因包括具有藥物主動(dòng)外排功能的ABC類型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因CDR1,MFS類型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因AGP2、GAP6、PHO84.3eoc和HOL3,應(yīng)激反應(yīng)和(或)解毒作用相關(guān)基因 AGP2和HOL3,麥角固醇生物合成相關(guān)基因 ERG12;表達(dá)下調(diào)的包括MFS類型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因FCY23和VCX1等基因。
結(jié)論:特比萘芬可使白
10、念珠菌多個(gè)與應(yīng)激反應(yīng)和(或)解毒作用相關(guān)的基因出現(xiàn)差異性表達(dá),導(dǎo)致多個(gè)具有藥物主動(dòng)外排功能的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因表達(dá)上調(diào),但對(duì)白念珠菌麥角固醇生物合成通路中的關(guān)鍵靶酶編碼基因影響不大?;蛐酒Y選出的其他差異表達(dá)基因也可能與特比萘芬的抗真菌作用機(jī)制有關(guān),值得進(jìn)一步研究。
第四部分應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片研究特比萘芬誘導(dǎo)白念珠菌耐藥前后基因的差異性表達(dá)
目的:應(yīng)用白念珠菌全基因組表達(dá)譜芯片比較特比萘芬體外誘導(dǎo)白念珠菌產(chǎn)生耐
11、藥性前后基因表達(dá)譜的差異,以了解白念珠菌對(duì)特比萘芬產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制。
方法:白念珠菌 ATCC90028菌株在濃度逐漸倍增的特比萘芬誘導(dǎo)下形成耐藥的白念珠菌ATCC90028-R株,應(yīng)用白念珠菌全基因組表達(dá)譜芯片比較白念珠菌 ATCC90028和ATCC90028-R株全基因組表達(dá)譜的差異,并應(yīng)用半定量RT-PCR方法對(duì)白念珠菌ATCC90028和ATCC90028-R株中部分差異表達(dá)基因的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。
結(jié)
12、果:基因芯片共篩選出109個(gè)差異表達(dá)基因,與白念珠菌 ATCC90028株比較,在ATCC90028-R株中有46個(gè)基因表達(dá)上調(diào),有63個(gè)基因表達(dá)下調(diào),半定量RT-PCR與全基因組表達(dá)譜芯片結(jié)果一致。表達(dá)上調(diào)基因包括分子轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒相關(guān)基因IPF5324和SIT1;表達(dá)下調(diào)基因包括11個(gè)蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、7個(gè)能量生成相關(guān)基因、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HXT5和STL1、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因CRD2和SOD22、以及多個(gè)金屬離子平衡相關(guān)基因。
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