逆轉(zhuǎn)座子激活對(duì)白念珠菌適應(yīng)性形成的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌是人類真菌感染主要的機(jī)會(huì)致病菌之一，目前許多潛在因素包括免疫抑制劑治療、抗生素治療、人類免疫缺陷病毒感染以及糖尿病等導(dǎo)致白念珠菌感染發(fā)病率升高，而白念珠菌本身對(duì)環(huán)境高度的高適應(yīng)能力更加重真菌感染的形勢(shì)。逆轉(zhuǎn)座子（retrotransposons）是一種可移動(dòng)基因片段，可經(jīng)RNA介導(dǎo)發(fā)生自主轉(zhuǎn)座，廣泛存在于多細(xì)胞的真核生物中，對(duì)真核生物的基因組結(jié)構(gòu)以及遺傳進(jìn)化都具有重要的影響。近年來關(guān)于逆轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性控制機(jī)制及其對(duì)宿主基因轉(zhuǎn)錄

2、表達(dá)影響的研究是當(dāng)前國(guó)際上生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題之一。本課題旨在發(fā)現(xiàn)白念珠菌中參與調(diào)控作用的逆轉(zhuǎn)座子，并初步探討逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性的可能機(jī)制，從遺傳進(jìn)化的角度解釋白念珠菌中的逆轉(zhuǎn)座子激活與其高適應(yīng)性形成的關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法，以白念珠菌SC5314為供試菌，考察參與損傷修復(fù)通路的基因在各種刺激條件下表達(dá)情況，并進(jìn)一步比較白念珠菌基因組中逆轉(zhuǎn)座子蛋白編碼區(qū)ORFs的表達(dá)差異以尋找具有轉(zhuǎn)錄活性的

3、逆轉(zhuǎn)座子。大量文獻(xiàn)提示逆轉(zhuǎn)座子的激活與DNA損傷相關(guān)，因此首先選擇直接作用于DNA分子的致癌劑MMS刺激，可引起參與損傷修復(fù)的基因，特別是參與同源重組修復(fù)的基因表達(dá)升高，并且可引起除TCA8（orf19.6078 and orf19.6079）以外的多數(shù)逆轉(zhuǎn)座子ORFs發(fā)生程度不同的轉(zhuǎn)錄激活，提示白念珠菌中存在著有活性的逆轉(zhuǎn)座子。在此基礎(chǔ)上，我們深入地研究一些重要的環(huán)境刺激因素（高滲透、氧化刺激、唑類藥物）濃度達(dá)到半數(shù)致死劑量（IC50

4、）時(shí)對(duì)白念珠菌逆轉(zhuǎn)座子蛋白編碼區(qū)ORFs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)影響。結(jié)果表明咪康唑（MCZ）和雙氧水（H2O2）刺激均可引起參與DNA損傷修復(fù)的基因廣泛地轉(zhuǎn)錄激活，并且在MCZ刺激6h時(shí)，TCA3 （ORF19.2219）、ZorrO2（ORF19.7274和ORF19.7275）以及TCA11（ORF19.6469）發(fā)生轉(zhuǎn)錄激活。H2O2刺激6 h時(shí)能選擇性地激活TCA8 （ORF19.6078和ORF19.6079）的轉(zhuǎn)錄活性，且在時(shí)間上修復(fù)基

5、因優(yōu)先于逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生活性。但在高滲透刺激條件下，無論是NaCl還是sorbital高滲透刺激，均未發(fā)現(xiàn)有活性的逆轉(zhuǎn)座子，對(duì)損傷修復(fù)基因的表達(dá)影響無上調(diào)作用。由此推測(cè)環(huán)境對(duì)逆轉(zhuǎn)座子表達(dá)活性的調(diào)節(jié)具有選擇性，其轉(zhuǎn)錄激活與細(xì)胞的損傷修復(fù)密切相關(guān)。
　　 為進(jìn)一步探討MCZ和H2O2刺激激活逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，本課題在MCZ和H2O2刺激前給予抗氧化劑NAC，比較二者聯(lián)合作用對(duì)菌株的生長(zhǎng)、逆轉(zhuǎn)座子、參與損傷修復(fù)基因的表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)ROS

6、水平三方面的影響。研究表明NAC與MCZ刺激聯(lián)合時(shí)可抑制MCZ的殺菌作用，有效地保護(hù)酵母態(tài)細(xì)胞，而與H2O2聯(lián)用卻對(duì)菌株的生長(zhǎng)情況無保護(hù)作用；NAC與二者聯(lián)合作用均可顯著地降低刺激所導(dǎo)致的損傷修復(fù)基因表達(dá)上調(diào)，并且刺激所激活的逆轉(zhuǎn)座子表達(dá)活性也會(huì)相應(yīng)的減弱或消失；熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧顯示NAC可有效地抑制MCZ、H2O2刺激所導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生積聚。提示MCZ和H2O2刺激后的ROS積聚使得細(xì)胞間接發(fā)生氧化損傷，同時(shí)啟動(dòng)DNA損傷

7、修復(fù)通路，調(diào)控逆轉(zhuǎn)座子的表達(dá)。
　　 最后，我們采用southern blotting技術(shù)深入分析這些激活的逆轉(zhuǎn)座子是否能夠參與復(fù)制周期的所有過程，直至形成完整的雙鏈DNA分子，進(jìn)一步評(píng)估轉(zhuǎn)錄活化的逆轉(zhuǎn)座子功能。實(shí)驗(yàn)首先在液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)時(shí)間的環(huán)境加壓刺激誘導(dǎo)若干株菌，通過酶切后的基因組與特定標(biāo)記的逆轉(zhuǎn)座子探針雜交顯色，發(fā)現(xiàn)MCZ誘導(dǎo)菌中Zorro2的拷貝片段明顯增加，而TCA3的拷貝片段反而減少；H2O2誘導(dǎo)菌也顯示可能發(fā)生TC