低能離子誘導(dǎo)玉米Mu轉(zhuǎn)座子激活及DNA甲基化表觀遺傳機(jī)制的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)座子是植物基因組的重要組成部分，對(duì)于研究植物基因組的組成、進(jìn)化和基因的表達(dá)調(diào)控等都具有重要意義。植物轉(zhuǎn)座子發(fā)掘、應(yīng)用和活性調(diào)控機(jī)制的研究是近年來植物遺傳育種和分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一。研究表明，植物在逆境脅迫條件下表觀遺傳變化是引起轉(zhuǎn)座子活性變異的重要機(jī)制。通過對(duì)一些模式植物如擬南芥和水稻的研究，人們已經(jīng)對(duì)植物在逆境脅迫條件下控制轉(zhuǎn)座子活性的表觀遺傳現(xiàn)象已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)植物表觀遺傳調(diào)控轉(zhuǎn)座子活性機(jī)理的研究還十分有限。本研究利用

2、低能氮離子對(duì)含單拷貝Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的玉米花粉進(jìn)行誘變，探索Mu轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特點(diǎn)和活性變異，并進(jìn)一步分析Mu轉(zhuǎn)座子的活性變異與其DNA甲基化表觀遺傳變化之間的關(guān)系。同時(shí)，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)玉米R(shí)NA介導(dǎo)的DNA甲基化表觀遺傳調(diào)控途徑的相關(guān)基因家族進(jìn)行鑒定和表達(dá)分析，以揭示其在表觀遺傳調(diào)控中的作用。獲得以下主要結(jié)果：
　　 1、通過低能N+離子注入單拷貝Mu轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)玉米花粉的研究發(fā)現(xiàn)，利用能量為30keV，注入劑量在2.4~3

3、.6×1015ion/cm2之間的N+離子，能夠有效地誘發(fā)玉米Mu轉(zhuǎn)座子活性變異。通過遺傳雜交獲得了子代籽粒，并根據(jù)Mu 轉(zhuǎn)座子活性變異的指示性狀，從子代籽粒中篩選出了兩種具有明顯表型特征變化的紫色斑點(diǎn)籽粒突變體。當(dāng)注入劑量為2.4×1015ion/cm2N+離子時(shí)，從7296個(gè)子代籽粒中篩選出了12個(gè)密度較稀的斑點(diǎn)籽粒，表明Mu轉(zhuǎn)座子被部分地激活（PA）；當(dāng)注入劑量為3.6×1015ion/cm2N+離子時(shí)，從5580個(gè)子代籽粒中篩選

4、出了10個(gè)密度較濃的斑點(diǎn)籽粒，表明Mu轉(zhuǎn)座子被完全地激活（FA）。
　　 2、通過Southern雜交、半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)了對(duì)照和突變體中非自主性的Mu1因子的轉(zhuǎn)座特點(diǎn)和自主性的MuDR調(diào)控因子表達(dá)水平。結(jié)果表明，兩種不同活性的Mu突變體中Mu1因子多態(tài)性明顯地高于對(duì)照植株，分別產(chǎn)生了1.7kb和1.3kb特異性的Mu1限制性片段，表明Mu1因子發(fā)生不同程度的切離轉(zhuǎn)座。半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不

5、同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同組織中與MuDR調(diào)控因子活性直接相關(guān)的mudrA和mudrB基因表現(xiàn)出差異性的表達(dá)水平。在突變體中，成熟的體細(xì)胞組織未表現(xiàn)出明顯的mudrA和mudrB基因的表達(dá)水平上調(diào)現(xiàn)象；然而，在生殖組織中卻表現(xiàn)出明顯的mudrA和mudrB基因的表達(dá)水平上調(diào)現(xiàn)象，表明了MuDR調(diào)控因子的激活主要發(fā)生在配子形成期。
　　 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)進(jìn)一步地顯示，突變體成熟的花粉組織中mudrA和mudrB基因的表達(dá)量分別較對(duì)

6、照提高了1.8～4.3倍和0.8～1.6倍，表明了MuDR調(diào)控因子在雄性配子中發(fā)生了明顯的激活3、通過限制性酶切和重亞硫酸鹽測(cè)序相結(jié)合的方法，對(duì)玉米MuDR調(diào)控因子的TIRA和TIRB末端區(qū)域的DNA甲基化位點(diǎn)進(jìn)行了定性和定量的檢測(cè)。結(jié)果表明，在突變體MuDR調(diào)控因子的TIRA和TIRB末端，三種不同模式的胞嘧啶位點(diǎn)（CpG，CpHpG和CpHpH）均較對(duì)照植株都發(fā)生了不同程度的去甲基化變異。其中，對(duì)稱的CpG和CpHpG胞嘧啶位點(diǎn)發(fā)生

7、去甲基化變異較顯著，分別較對(duì)照植株降低了35.3～55.9％和38.9～60.0％；而非對(duì)稱的CpHpH胞嘧啶位點(diǎn)發(fā)生去甲基化變異較小，較對(duì)照植株降低了3.0～6.1％。此外，從單個(gè)的胞嘧啶位點(diǎn)甲基化變異情況分析發(fā)現(xiàn)，一些與MuDR的活性相關(guān)的重要位點(diǎn)，如32bp核苷酸組成的轉(zhuǎn)座酶的結(jié)合位點(diǎn)（MBS），一個(gè)特征性的SacI酶切位點(diǎn)以及mudrA和mudrB基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域內(nèi)所含的胞嘧啶位點(diǎn)均發(fā)生了不同程度的去甲基化變異，表明這些位

8、點(diǎn)的去甲基化變異直接影響著MuDR調(diào)控因子的活性變化。
　　 4、通過生物信息學(xué)和半定量RT-PCR的方法鑒定與分析了5個(gè)編碼DCL蛋白的基因（Zmdcl），18個(gè)編碼AGO蛋白的基因（Zmago），5個(gè)編碼RDR蛋白的基因（Zmrdr）以及8個(gè)編碼DMT 蛋白的基因（Zmet）及其表達(dá)情況。通過與擬南芥和水稻的同源基因的序列比較和進(jìn)化關(guān)系分析表明，大部分基因的序列都是高度保守的，均具有其非常保守的功能基序和重要的功能結(jié)構(gòu)域，預(yù)

9、測(cè)其與擬南芥和水稻的同源基因編碼蛋白具有類似的功能；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示玉米、水稻和擬南芥中這些功能基因家族都進(jìn)化成了四個(gè)不同的亞族，但在進(jìn)化上玉米和水稻的同源基因比擬南芥具有更近的親緣關(guān)系。同時(shí)，在兩種非生物脅迫處理下，通過對(duì)這些基因家族的表達(dá)譜的分析顯示，這些基因在不同的脅迫處理下表現(xiàn)出差異性的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)這些基因家族的不同成員在RNA介導(dǎo)的DNA甲基化調(diào)控途徑中可能具有不同的功能，為下一步對(duì)這些基因的克隆和功能驗(yàn)證提供了理論依據(jù)。