法尼醇對(duì)白念珠菌cAMP-PKA信號(hào)通路作用的研究.pdf

1、目的:白念珠菌耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)而導(dǎo)致念珠菌感染下降的治愈率引起越來(lái)越多人們的關(guān)注，而法尼醇可以增加多種微生物對(duì)藥物的易感性。本研究探討法尼醇對(duì)白念珠菌浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)對(duì)氟康唑藥物的易感性影響;通過構(gòu)建白念珠菌耐藥株闡明法尼醇對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及耐藥株生物被膜狀態(tài)cAMP-PKA信號(hào)通路的調(diào)控作用及其與耐藥的相關(guān)性。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:實(shí)驗(yàn)分為法尼醇處理白念珠菌浮游組，生物被膜組以及各自法尼醇未處理對(duì)照組。采用XTT檢測(cè)

2、吸光光度值大小從而分析法尼醇處理對(duì)白念珠菌浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)對(duì)氟康唑藥物易感性的差異。
　　實(shí)驗(yàn)二:研究菌株為:白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及利用白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株誘導(dǎo)的白念珠菌耐藥株。實(shí)驗(yàn)分組如下:法尼醇處理白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜，法尼醇未處理白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株生物被膜，法尼醇處理白念珠菌耐藥株生物被膜及法尼醇未處理白念珠菌耐藥株生物被膜組。提取白念珠菌生物被膜全RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)檢測(cè)法尼醇對(duì)白念珠菌不同生物被膜時(shí)相cAMP

3、-PKA信號(hào)通路相關(guān)基因Ras1，Gpa2，Cap1，Sgt1，Cyr1，Pde1，Pde2，Pka1，Bcy1，Tpk2，fg1表達(dá)的調(diào)控作用;提取白念珠菌生物被膜蛋白質(zhì)，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)法尼醇對(duì)cAMP-PKA通路RAS1，CYR1，PDE2，BCY1蛋白表達(dá)的作用。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:XTT結(jié)果顯示:浮游狀態(tài)的白念珠菌對(duì)氟康唑的易感性是白念珠菌生物被膜狀態(tài)的8～61倍(P＜0.001

4、)。同法尼醇未處理浮游狀態(tài)白念珠菌相比，法尼醇處理后的浮游狀態(tài)白念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性無(wú)明顯改變（P＞0.05）。同法尼醇未處理生物被膜狀態(tài)白念珠菌相比，法尼醇處理后生物被膜狀態(tài)白念珠菌對(duì)氟康唑的敏感性增高（P＜0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二:q-PCR結(jié)果:
　　法尼醇處理標(biāo)準(zhǔn)株組同法尼醇未處理標(biāo)準(zhǔn)株組比較:在生物被膜形成6h，Ras1，Cap1，Sgt1，Cyr1，Pde1，Pka1，Bcy1，Tpk2，fg1表達(dá)下調(diào)，Pde

5、2表達(dá)上調(diào)，其余基因表達(dá)無(wú)明顯改變;在12 h,Ras1基因表達(dá)下調(diào)，Cap1，Cyr1，Pde1，Pde2，Pka1，Bcy1，Tpk2基因表達(dá)上調(diào)，其余基因表達(dá)無(wú)明顯改變;在24 h，Ras1，Cyr1基因表達(dá)下調(diào)，Pka1，Pde1，Pde2基因表達(dá)上調(diào)，其余基因表達(dá)無(wú)明顯改變;在36h，Ras1，Cyr1基因表達(dá)下調(diào)，Pka1基因表達(dá)上調(diào)，其他基因表達(dá)無(wú)明顯改變。其中，法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6h，12h，24 h和36

6、h表達(dá)均下調(diào)，Pde2在生物被膜6h，12h和24 h表達(dá)均上調(diào)，在生物被膜36 h表達(dá)沒有明顯改變，Cyr1在生物被膜6h,24h和36h表達(dá)均下調(diào)，在生物被膜12h表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。
　　法尼醇處理耐藥株組同法尼醇未處理耐藥株組比較:在生物被膜6h，Ras1，Pka1，Bcy1，Tpk2表達(dá)下調(diào)，Cap1，Pde1，Pde2基因表達(dá)上調(diào)，其余基因無(wú)明顯改變;在12h，Ras1，Sgt1基因表達(dá)下調(diào)，Cyr1，Pde2,

7、Pka1，Bcy1基因表達(dá)上調(diào)，其余基因無(wú)明顯改變;在24 h，Ras1，Cap1基因表達(dá)下調(diào)，Pde1，Pde2，Bcy1基因表達(dá)上調(diào)，其余基因無(wú)明顯改變.在36 h，Ras1，Cyr1，Pde2基因表達(dá)下調(diào)，Cap1，Pka1，Bcy1，Tpk2,Efg1基因表達(dá)上調(diào)，其余無(wú)基因明顯改變。其中，法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6h，12h，24 h和36 h表達(dá)均下調(diào)，Pde2在生物被膜6，12和24 h表達(dá)均上調(diào)，在生物被膜36

8、h表達(dá)下調(diào)，Cyr在生物被膜12 h表達(dá)上調(diào)，在生物被膜36h表達(dá)下調(diào)，在其余時(shí)間沒有明顯改變(P＜0.01）。
　　耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株比較:在生物被膜6 h,Pde1，Pde2表達(dá)下調(diào)，Cyr1，Tpk2表達(dá)上調(diào)，其余基因無(wú)明顯改變;在12 h，Pde1，Pde2基因表達(dá)下調(diào)，Cyr1，Tpk2基因表達(dá)上調(diào)，其余無(wú)基因明顯改變;在24 h，Cyr1，Tpk2,Efg1基因表達(dá)上調(diào)，其余基因無(wú)明顯改變;在36h，Sgt1，Pde1，P

9、de2基因表達(dá)下調(diào)，Bcy1基因表達(dá)上調(diào)，其余基因無(wú)明顯改變。其中，法尼醇作用基因Ras1在生物被膜6h，12h，24 h和36 h表達(dá)均無(wú)明顯改變，Pde2在生物被膜6h，12h和36 h表達(dá)均上調(diào)，在生物被膜24 h表達(dá)無(wú)明顯改變，Cyr1在生物被膜6h，12h和24 h表達(dá)上調(diào)，在生物被膜36h表達(dá)沒有明顯改變（P＜0.01）。
　　Western Blot結(jié)果顯示:
　　法尼醇處理標(biāo)準(zhǔn)株組同法尼醇未處理標(biāo)準(zhǔn)株組比較:

10、在生物被膜6h，RAS1，CYR1，BCY1蛋白表達(dá)水平下調(diào)，PDE2蛋白表達(dá)水平上調(diào);在12h，RAS1表達(dá)水平下調(diào)，CYR1，PDE2，BCY1表達(dá)水平均上調(diào);在24 h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達(dá)水平均下調(diào);在36h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達(dá)水平均下調(diào)。其中，法尼醇作用蛋白R(shí)AS1在生物被膜6h，12h，24 h和36h表達(dá)均下調(diào)，PDE2在6h和12h表達(dá)上調(diào)，在24 h和36h表達(dá)下調(diào)，CYR

11、1在6h，24 h和36 h表達(dá)下調(diào)，在12h表達(dá)上調(diào)。
　　法尼醇處理耐藥株組同法尼醇未處理耐藥株組比較:在生物被膜6h，RAS1，CYR1，BCY1蛋白表達(dá)水平下調(diào)，PDE2蛋白表達(dá)水平上調(diào);在12h，RAS1表達(dá)水平下調(diào)，CYR1，PDE2，BCY1表達(dá)水平均上調(diào);在24 h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達(dá)水平均下調(diào);在36h，RAS1 CYR1，PDE2，BCY1表達(dá)水平均下調(diào)。其中，法尼醇作用蛋白R(shí)AS1在生

12、物被膜6h，12h，24 h和36h表達(dá)均下調(diào)，PDE2在6h和12h表達(dá)上調(diào)，在24 h和36 h表達(dá)下調(diào)，CYR1在6h，24 h和36 h表達(dá)下調(diào)，在12h表達(dá)上調(diào)。
　　耐藥株組與標(biāo)準(zhǔn)株組比較:在生物被膜6h，RAS1，BCY1，CYR1表達(dá)水平無(wú)明顯改變，PDE2表達(dá)水平下調(diào);在12h，RAS1，BCY1，CYR1表達(dá)水平無(wú)明顯改變，PDE2表達(dá)水平下調(diào);在24 h，RAS1，BCY1，PDE2表達(dá)水平無(wú)明顯改變，CYR

13、1表達(dá)上調(diào);在36h，RAS1，BCY1，PDE2表達(dá)水平無(wú)明顯改變，CYR1表達(dá)上調(diào)。其中，法尼醇作用蛋白R(shí)AS1在生物被膜6h，12h，24 h和36 h表達(dá)均無(wú)明顯改變，PDE2在6h和12 h表達(dá)下調(diào)，在24 h和36 h表達(dá)沒有明顯改變，CYR1在24 h和36h表達(dá)上調(diào)，在6h和12h表達(dá)沒有明顯改變。
　　結(jié)論:
　　實(shí)驗(yàn)一:浮游狀態(tài)下白念珠菌對(duì)氟康唑的藥物易感性遠(yuǎn)高于生物被膜狀態(tài)。法尼醇對(duì)浮游狀態(tài)和生物被膜狀

14、態(tài)白念珠菌的藥物易感性的作用不同:法尼醇未改變浮游狀態(tài)白念珠菌對(duì)氟康唑的藥物易感性;法尼醇增高了生物被膜狀態(tài)的白念珠菌對(duì)氟康唑的藥物易感性。
　　實(shí)驗(yàn)二:法尼醇對(duì)白念珠菌生物被膜的調(diào)控作用與生物被膜形成時(shí)相相關(guān)，不同生物被膜時(shí)相法尼醇調(diào)控的基因蛋白及其表達(dá)存在差異。法尼醇可能通過調(diào)控cAMP-PKA信號(hào)通路耐藥分子的表達(dá)影響白念珠菌生物被膜的耐藥性。法尼醇對(duì)cAMP-PKA信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用是一個(gè)雙向的，根據(jù)不同生物被膜時(shí)相，它的