日本血吸蟲逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA診斷靶序列的篩選及其研究.pdf

1、核酸檢測具有與病原診斷同等的確診價值，因此，核酸檢測法用于血吸蟲感染的診斷及療效考核已成為近年來血吸蟲病分子診斷技術(shù)的研究熱點(diǎn)。靶序列的選擇是決定核酸診斷方法敏感性及特異性的關(guān)鍵因素之一。本課題組前期獲得的SjR2的230bp靶序列在日本血吸蟲感染家兔及病人血清特異性DNA檢測中顯示了較好的敏感性和特異性。在此基礎(chǔ)上，本研究通過對25個新發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA檢測敏感性及特異性的研究，成功篩選到一段來自于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS19

2、分子量為303bp的靶序列，探討了日本血吸蟲核酸檢測靶序列的選擇依據(jù)，進(jìn)一步建立了303bp靶序列的nested-PCR檢測法，顯示了對日本血吸蟲感染家兔模型的早期診斷和療效考核價值，并評價了nested-PCR法應(yīng)用于日本血吸蟲病患者的診斷及療效考核效果。同時本研究還初步建立了針對SjCHGCS19靶序列的LAMP法，并探討了在血吸蟲感染家兔血清DNA檢測中的應(yīng)用價值。全文共分五個部分：
　　 第一部分，25個日本血吸蟲逆轉(zhuǎn)錄

3、轉(zhuǎn)座子DNA診斷靶序列的篩選
　　 在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)了來源于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjR2分子量為230bp的靶序列，用于檢測日本血吸蟲感染宿主血清DNA，顯示出高度的敏感性和特異性。本研究針對日本血吸蟲基因組中新發(fā)現(xiàn)的25個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子設(shè)計引物，應(yīng)用普通PCR方法檢測日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、肝吸蟲、肺吸蟲及旋毛蟲的DNA，評價不同靶序列檢測血吸蟲DNA的敏感性和特異性，以期尋找敏感、特異具有診斷價值的新靶序列，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了來源

4、于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS19(擴(kuò)增區(qū)段為2049bp～2334bp)分子量為303bp的靶序列，用于檢測日本血吸蟲DNA顯示出高度的敏感性（最高檢測敏感性21.5fg/μL）。該靶序列與曼氏血吸蟲具有交叉反應(yīng)，而與肝吸蟲、肺吸蟲及旋毛蟲均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
　　 第二部分，25個日本血吸蟲逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA診斷靶序列的生物信息學(xué)分析
　　 本研究對SjR2及25個新的日本血吸蟲逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基本生物信息學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，

5、探討影響日本血吸蟲DNA核酸檢測敏感性及特異性的相關(guān)因素。采用SAS軟件進(jìn)行多重線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲DNA的PCR檢測敏感性與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座予的完整拷貝數(shù)及其ESTs活躍度呈密切相關(guān)，同時還受到逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在整個血吸蟲基因組中所占的比例等其它基本生物信息學(xué)特征的影響。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，已獲得的2個具有高度檢測敏感性和特異性的靶序列（230bp和303bp）分別來源于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjR2和SjCHGCS19，二者在日本血吸蟲基因組中均具

6、有較高的完整拷貝數(shù)(分別是400，793)，更高的部分重復(fù)拷貝數(shù)(分別是23，755，17，373)及較高的ESTs活躍度(分別是79，39)，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中同屬于非長末端逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的SR2家族。以上生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，靶序列在基因組中的完整拷貝數(shù)及其ESTs活躍程度可能是決定日本血吸蟲DNA檢測敏感性0的關(guān)鍵因素之一，而特異性則主要與靶序列和其它物種是否具有同源序列相關(guān)。
　　 第三部分，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS1

7、9的303bp靶序列用于日本血吸蟲感染宿主早期診斷及療效考核
　　 以逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS19的303bp片段為靶序列，通過nested-PCR方法探討其用于日本血吸蟲DNA檢測的敏感性和特異性，同時應(yīng)用于日本血吸蟲不同感染度宿主外周血清的DNA檢測，進(jìn)一步探索該靶序列在日本血吸蟲病早期診斷及療效考核中的應(yīng)用價值。以nested-PCR外引物擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA作為模板，評價303bp靶序列檢測DNA的敏感性，結(jié)果

8、顯示最高的檢測敏感性可達(dá)2.02個拷貝，比230bp靶序列的檢測敏感性（10.2個拷貝）高5倍。應(yīng)用303bp靶序列對日本血吸蟲感染家兔模型的不同組織樣本（包括日本血吸蟲成蟲、感染家兔的肝組織和外周血清）均可以檢測到日本血吸蟲特異的DNA片段，該靶序列與曼氏血吸蟲有交叉反應(yīng)，而與肝吸蟲、肺吸蟲及旋毛蟲均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。在中、低度感染宿主血清中均可擴(kuò)增出陽性條帶，特別是可以從感染后第3d的家兔血清中擴(kuò)增出特異條帶，并于治療后第18w即轉(zhuǎn)為

9、陰性。研究結(jié)果表明應(yīng)用303bp靶序列檢測日本血吸蟲感染宿主血清特異性DNA具有早期診斷及療效考核價值。
　　 第四部分，303bp靶序列在日本血吸蟲病患者診斷及療效考核中的應(yīng)用
　　 在動物模型實(shí)驗(yàn)研究取得較好效果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用nested-PCR法評價303bp靶序列用于日本血吸蟲病慢性期病人(EPG陽性)血清DNA的檢測效果，結(jié)果顯示，43例慢性病人血清及51例健康人血清檢測結(jié)果的敏感性為97.7％，特異性為96.

10、1％，陽性預(yù)測值為97.7％，陰性預(yù)測值為96.1％。其陽性檢出率隨著病人感染度的降低而降低，特別是對低度感染病人的陽性檢出率仍然可以達(dá)到96.9％。進(jìn)一步對47例治療后3、6、9個月日本血吸蟲病人血清DNA檢測的療效考核價值進(jìn)行評價，結(jié)果表明其陰轉(zhuǎn)率分別為36.2％、89.4％和87.2％，隨治療時間延長呈明顯上升趨勢，特別是治療后6個月已達(dá)89.4％，顯示出較好的療效考核價值。而常規(guī)免疫學(xué)檢測方法IHA檢測的治療后3、6、9個月病人

11、血清抗體的陰轉(zhuǎn)率分別為23.4％、42.6％和31.9％，ELISA法檢測治療后3、6、9個月病人血清抗體的陰轉(zhuǎn)率分別為19.1％、17.0％和25.5％。
　　 第五部分，基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS19的靶序列篩選及LAMP法建立
　　 在逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS19的303bp靶序列所建立的nested-PCR檢測法取得較好敏感性和特異性的研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探索了靈敏度高，方法簡便、快速更適宜于疫區(qū)現(xiàn)場應(yīng)

12、用的LAMP法，分別選取了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SjCHGCS19的4個不同區(qū)段作為擴(kuò)增靶序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增區(qū)段位于211bp～441bp處的一段靶序列顯示了較好的檢測敏感性，達(dá)到了130fg/μL。并在日本血吸蟲感染200條、100條及50條尾蚴家兔模型血清中檢測出陽性結(jié)果，但是未能檢測出感染30條尾蚴的家兔血清DNA，低于來源于SjCHGCS19的303bp靶序列(擴(kuò)增區(qū)段為2049～2334bp)建立的nested-PCR法的檢測敏感性(2