白念珠菌新型耐藥基因MXR1面朝藥機(jī)制的研究.pdf

1、白念珠菌由于具有高適應(yīng)性和高耐藥性，因此易于感染而難以防治。近年來(lái)，國(guó)際上有大量關(guān)于白念珠菌適應(yīng)氧化應(yīng)激機(jī)制的研究，并有大量文獻(xiàn)提示，白念珠菌氧化應(yīng)激機(jī)制可能與其對(duì)唑類藥物的耐藥性有關(guān)。因此，白念珠菌氧化應(yīng)激對(duì)于全面闡述其耐藥機(jī)制有著十分重要的意義。
　　 研究目的通過(guò)基因敲除的方法，構(gòu)建MXR1基因缺失菌株，從而研究MXR1基因缺失后對(duì)菌株生長(zhǎng)、藥物敏感性、對(duì)H2O2的耐受能力、細(xì)胞內(nèi)活性氧、谷胱甘肽還原體系、線粒體膜電位、氧

2、化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)、CDR1等重要的耐藥基因表達(dá)、菌絲形成、羅丹明外排及滲透敏感性的變化。
　　 研究方法1.構(gòu)建基因敲除載體質(zhì)粒:利用PCR、雙酶切及DNA連接法，構(gòu)建MXR1基因敲除載體質(zhì)粒，該質(zhì)粒是以p5921質(zhì)粒為基礎(chǔ)，含有MXR1基因ORF兩側(cè)的上下游片段及hisG-Ura3-HisG片段。構(gòu)建后分別采用PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定法，鑒定每一步的陽(yáng)性質(zhì)粒。2.構(gòu)建基因缺失菌:通過(guò)URA-Blaster法構(gòu)建MXR1基因缺

3、失菌株，每一步采用PCR鑒定，最后的陽(yáng)性菌株采用Southern-blot鑒定。3.生長(zhǎng)曲線:將野生菌與MXR1基因缺失菌株，等濃度培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量各菌株的OD600值，從而得到各株菌的生長(zhǎng)曲線。4.MXR1基因缺失菌對(duì)藥物敏感性的實(shí)驗(yàn):通過(guò)MIC80和Spot-assay實(shí)驗(yàn)，研究MXR1基因缺失菌對(duì)藥物敏感性的變化。5.MXR1基因缺失菌對(duì)H2O2耐藥力的實(shí)驗(yàn):通過(guò)H2O2液基搖培實(shí)驗(yàn)、Spot-assay實(shí)驗(yàn)，研究MXR1

4、基因缺失菌對(duì)H2O2耐藥力的變化。6.細(xì)胞內(nèi)活性氧——ROS含量的測(cè)定:將2，7-二氫二氯熒光素二乙酯——DCFH-DA與菌株共培養(yǎng)，在不同時(shí)間測(cè)定熒光值，從而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量。7.氧化型和還原型谷胱甘肽含量測(cè)定:通過(guò)谷胱甘肽還原酶及總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒測(cè)定氧化型和還原型谷胱甘肽含量。8.線粒體膜電位測(cè)定:通過(guò)線粒體膜電位試劑盒測(cè)定線粒體膜電位。9.通過(guò)Real-time RT-PCR法，測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)基因SOD2、T

5、RR1、GLR1表達(dá)情況。10.通過(guò)Real-time RT-PCR法，測(cè)定重要耐藥相關(guān)基因CDR1、CDR2、MDR1、ERG11表達(dá)情況。11.在含有小牛血清(FBS)、Lee's、Spider的培養(yǎng)基培養(yǎng)，以觀察MXR1基因缺失對(duì)菌絲形成的影響。12.羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn):在菌株中加入羅丹明6G測(cè)定菌株的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。13.MXR1基因缺失對(duì)白念珠菌滲透刺激敏感性的影響:通過(guò)Spot-assay實(shí)驗(yàn)，觀察菌株對(duì)于SDS、CaCl2、

6、LiCl的滲透刺激敏感性的改變。
　　 結(jié)果1.本研究首先構(gòu)建了MXR1基因敲除載體質(zhì)粒，并采用Ura-blaster方法將白念珠菌中的MXR1基因敲除，從而進(jìn)行后續(xù)的表型分析，進(jìn)而獲得該基因功能的相關(guān)信息。2.本研究考察了MXR1基因?qū)τ诎啄钪榫哪退幮缘挠绊憽XR1基因缺失后，菌株對(duì)唑類藥物敏感性明顯上升，對(duì)丙烯胺類及多烯類藥物敏感性無(wú)明顯變化。3.本研究考察了MXR1基因?qū)τ诎啄钪榫?xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激機(jī)制的影響。MXR1基因

7、缺失后，(1)菌株對(duì)H2O2的耐受能力下降;(2)細(xì)胞內(nèi)活性氧——ROS水平升高;(3)線粒體膜電位——△ψm增高;(4)某些與氧化還原相關(guān)基因（如SOD2等）表達(dá)無(wú)明顯變化;(5)細(xì)胞內(nèi)還原型GSH/氧化型GSSG的比值無(wú)明顯變化。上述結(jié)果提示，MXR1基因在白念珠菌細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制中可能起到作用。4.MXR1基因缺失后:(1)菌株中CDR1、MDR1的表達(dá)略有上升，(2)而CDR2、ERG11表達(dá)無(wú)明顯變化;(3) MXR1基因缺

8、失對(duì)于白念珠菌菌絲的形成無(wú)明顯的影響;(4) MXR1基因缺失不影響白念珠菌的滲透敏感性。
　　 結(jié)論白念珠菌的MXR1基因缺失后，對(duì)于H2O2的耐受力顯著下降，說(shuō)明MXR1基因可能參與了白念珠菌的氧化應(yīng)激體系，導(dǎo)致白念抗氧化的能力下降。后來(lái)我們又發(fā)現(xiàn)，MXR1基因敲除后，白念珠菌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)明顯升高，本研究首次證實(shí)了MXR1基因可減少對(duì)ROS的清除。ROS產(chǎn)生的主要部位位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，目前國(guó)際上通常用線粒體膜電位作

9、為測(cè)試線粒體功能的重要指標(biāo)。由于ROS受MXR1基因的影響，我們進(jìn)一步考慮MXR1的敲除對(duì)于△ψm的影響。結(jié)果表明在MXR1基因缺失后，白念珠菌的△ψm顯著升高。說(shuō)明白念珠菌對(duì)于H2O2的耐受力顯著下降，可能是由于ROS升高、線粒體膜電位升高引起的，因此我們推測(cè)，MXR1基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激的影響，可能是通過(guò)升高線粒體膜電位，并減少對(duì)ROS清除而完成的。另外，我們也發(fā)現(xiàn)，MXR1基因缺失不改變谷胱甘肽還原體系及氧化應(yīng)激體系中的某些重要基因，如

10、谷胱甘肽還原酶基因——GLR1、錳-超氧化物歧化酶基因——SOD2和硫氧還蛋白還原酶基因——TRR1的表達(dá)，通過(guò)本研究中實(shí)時(shí)定量RT-PCR顯示，這三個(gè)基因在MXR1敲除前后表達(dá)無(wú)明顯改變。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，MXR1基因缺失菌對(duì)于氧化應(yīng)激的影響，可能不通過(guò)這些已知的氧化還原相關(guān)基因完成。MXR1參與了白念珠菌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示:與親本菌株RM1000相比較，MXR1基因敲除菌中CDR1及MDR

11、1基因表達(dá)略有上升，但是CDR2及ERG11基因的表達(dá)無(wú)明顯變化。因此我們采用檢測(cè)熒光染料羅丹明6G的含量的方法，來(lái)檢測(cè)白念珠菌的外排功能。親本菌和MXR1基因缺失菌對(duì)羅丹明6G熒光外排沒(méi)有明顯差異，這與之前的Real-time RT-PCR結(jié)果中MXR1基因敲除菌CDR1表達(dá)略有上升產(chǎn)生矛盾，我們分析可能是由于CDR1基因表達(dá)水平僅上升了2.5倍，而后期編碼翻譯的過(guò)程沒(méi)有明顯變化有關(guān)。另外我們研究了MXR1基因缺失后菌絲的形成和滲透刺

12、激敏感性的變化，結(jié)果表明，MXR1基因缺失對(duì)這兩者沒(méi)有明顯的影響。文獻(xiàn)報(bào)道唑類藥物除了有已知的抑制麥角固醇的生物合成機(jī)制外，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量從而達(dá)到抑菌作用也是咪康唑抑制白念珠菌生長(zhǎng)的重要機(jī)制;抗氧化劑可以顯著減弱咪康唑的抑菌作用，細(xì)胞內(nèi)活性氧與唑類耐藥機(jī)制有著密不可分的關(guān)系，而白念珠菌細(xì)胞內(nèi)，對(duì)于ROS的清除增多可能與其對(duì)唑類的耐藥有關(guān)。我們分別證明了MXR1基因缺失可導(dǎo)致菌株對(duì)唑類藥物的敏感性增加，同時(shí)菌株內(nèi)的ROS增加。結(jié)合