胺碘酮與唑類藥物的聯(lián)合抗真菌作用及機制研究.pdf

1、近半個世紀以來，隨著醫(yī)藥科技的迅猛發(fā)展，臨床上抗生素的使用日趨廣泛，很容易引起人們發(fā)生菌群失調；而及免疫抑制劑、激素、抗腫瘤化療和細胞毒性藥物等的大量應用，可以降低機體的免疫機能；再加上留置導管、血液透析、消化道內窺等的侵入性操作增加了病源菌感染的機會；這些風險因素單獨或相互疊加起作用使條件致病菌一尤其是真菌感染的發(fā)生率正在不斷上升，念珠菌屬特別是白色念珠菌的臨床分離率最高。真菌感染發(fā)展迅速，如果得不到及時治療，可導致患者死亡。與此同時

2、，隨著抗真菌藥物的大量應用，其選擇壓力可將耐藥菌變?yōu)閮?yōu)勢菌，并誘導真菌發(fā)生基因突變，從而使真菌耐藥率不斷增加，真菌感染的治療越來越困難。聯(lián)合用藥作為解決耐藥真菌感染的主要方法之一，成為近年來的研究熱點，受到廣泛關注。 抗心律失常藥物胺碘酮(amiodarone，AMD)是治療心房顫動的一線用藥，是預激綜合癥伴頑固性心律失常病人的首選藥物。最新文獻報道胺碘酮具有新奇的廣譜的殺真菌活性，且與小劑量氟康唑聯(lián)用時具有協(xié)同抗真菌作用。本實

3、驗在全面測定了胺碘酮與唑類藥物單用或聯(lián)合應用的靜態(tài)和動態(tài)抗真菌作用的基礎上，進一步研究了胺碘酮對唑類抗真菌藥物的增敏作用機制，并觀察了藥物作用對真菌細胞形態(tài)學的影響。 一、胺碘酮與唑類藥物的靜態(tài)聯(lián)合抗真菌作用參照修訂后的CLSI M27-A2方案，設置胺碘酮濃度范圍0.5～256μg/ml，氟康唑濃度范圍0.25～256μg/ml，伊曲康唑和伏立康唑濃度范圍0.008～64μg/ml進行藥物的抗真菌作用測定。結果表明CA5，CA

4、8，CAl2，CAl4，CAl29為敏感白色念珠菌，CA1O，CA15，CA16，CA135，CA137為唑類交叉耐藥白色念珠菌；胺碘酮對所有菌株的抗真菌作用都很弱。 應用棋盤法測定胺碘酮與唑類藥物對上述白色念珠菌的靜態(tài)聯(lián)合抗真菌作用，設置胺碘酮濃度范圍0.125-8μg/ml，氟康唑濃度范圍O.125～128μg/ml，伊曲康唑和伏立康唑濃度范圍0.008-8μg/ml，以分數(shù)抑菌濃度指數(shù)(FICI法)、反映面模型(RSM法)

5、、非參數(shù)反應面(AE法)三種方法進行全面評價。結果顯示藥物聯(lián)合對白色念珠菌耐藥株的FICI的平均值為0.010；RSM法的協(xié)同拮抗參數(shù)ICα均大于0，且其對應的95％致信區(qū)間也大于0：AE法的協(xié)同百分數(shù)和(∑SYN)的平均值為1250％，拮抗百分數(shù)和(EANT)的平均值為-18.7％，即聯(lián)合用藥對耐藥菌表現(xiàn)協(xié)同作用。同時，實驗測得藥物聯(lián)合對白色念珠菌敏感株的FICI的平均值為1.84；RSM法各組的協(xié)同參數(shù)α均大于O，但其對應的95％致

6、信區(qū)間均包含0；△E法的∑SYN的平均值為59％，EANT的平均值為-138.5％，即聯(lián)合用藥對敏感菌表現(xiàn)為無關作用。對三種評價方法進行比較發(fā)現(xiàn)，非參數(shù)法更適用于評價抗真菌藥物與非抗真菌藥物的聯(lián)合作用效果。 二、胺碘酮與唑類藥物的動態(tài)聯(lián)合抗真菌作用應用時間.殺菌曲線法測定胺碘酮與唑類藥物對耐藥白色念珠菌CA10、敏感白色念珠菌CA14的動態(tài)聯(lián)合抗真菌作用。篩選出胺碘酮藥物濃度4μg/ml，氟康唑藥物濃度8μg/ml，伊曲康唑和伏

7、立康唑藥物濃度0.5μg/ml進行測定。在體系培養(yǎng)的第O、6、12、24、48h的時間點，通過活菌計數(shù)和XTT(二甲氧唑黃法)兩種方法獲得真菌細胞數(shù)量，并對第48h菌液濃度的常用對數(shù)值(Log10CFU/ml)進行分析比較。結果顯示動態(tài)聯(lián)合抗真菌作用測定證實了胺碘酮本身弱的抗真菌活性；證實了胺碘酮對唑類藥物抗耐藥菌的協(xié)同作用，即與唑類藥物相比，聯(lián)合用藥菌濃度常用對數(shù)下降值≥2；證實了胺碘酮對唑類藥物抗敏感菌的無關作用，即與唑類藥物相比，

8、聯(lián)合用藥菌濃度常用對數(shù)下降值≤1。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)活菌計數(shù)法與XTT法具有良好的一致性，相關系數(shù)r=0.9622. 三、細胞外的鈣調節(jié)與藥物作用應用平板劃線法測定胺碘酮與唑類藥物對耐藥白色念珠菌CAl0、CAl37，敏感白色念珠菌CA8、CAl4的聯(lián)合抗真菌作用以及細胞外的鈣調節(jié)對聯(lián)合作用的影響。設置4.5xl05CFU/ml的菌液劃線接種于含有一定濃度胺碘酮、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑以及各種鈣調節(jié)劑的YPD瓊脂培養(yǎng)基上，3

9、5℃恒溫培養(yǎng)48h。結果顯示，胺碘酮顯著增強了唑類藥物對耐藥菌的作用，稍稍增強了唑類藥物對敏感菌的作用；鈣通道激活劑BayK8644不影響聯(lián)合用藥的效果；低濃度鈣離子對耐藥菌敏感菌都有生長促進作用，可以減弱聯(lián)合用藥的效果；高濃度鈣離子、鈣離子絡合劑EGTA、EDTA$t耐藥菌敏感菌都有生長抑制作用，可以增強聯(lián)合用藥的效果；鈣通道阻滯劑貝尼地平可顯著增強聯(lián)合用藥對耐藥菌的作用，稍稍增強聯(lián)合用藥對敏感菌的作用。 四、胺碘酮增敏作用與

10、胞內鈣離子的關系Fluo-3/AM是跨膜的鈣熒光指示劑，可以迅速與細胞內鈣離子結合，經(jīng)可見光激發(fā)后發(fā)出熒光，定性反映細胞內的鈣離子脈沖變化。應用流式細胞術測定藥物聯(lián)合作用對耐藥白色念珠菌CAlO細胞內鈣離子的影響。菌株在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以D-Hanks緩沖液清洗細胞，重懸并調節(jié)菌濃度約為107CFU/ml，37℃ 120mm下3μ的Fluo-3/AM避光負載30min，流式細胞儀測定藥物加入后細胞內鈣離子的變化。結果

11、顯示，胺碘酮可增加基礎鈣的雙相升高(第一相和第三相)，這與胺碘酮的弱抗真菌作用一致；氟康唑對細胞內鈣離子濃度的影響較小，但可以將基礎鈣的低水平雙相升高逆轉為單相升高(第二相)；胺碘酮對唑類藥物抗耐藥菌的增敏作用在于促進了細胞內鈣庫的鈣的釋放，極大的提高了胞漿內鈣離子濃度。 五、胺碘酮對細胞內唑類藥物蓄積的影響羅丹明6G(Rhodamine 6G，R6G)是一種熒光物質，可被動擴散進入真菌細胞，與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑同為白色

12、念珠菌主動外排泵CDR(CandidaDrug Resistance)的底物。我們應用熒光法測定胺碘酮對白色念珠菌蓄積羅丹明6G的影響，并進一步應用流式細胞術研究藥物對白色念珠菌吸收、泵出羅丹明6G的影響。耐藥菌CAl0、CAl35，敏感菌CA8和CAl4在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，采用YPD液體培養(yǎng)液測定羅丹明6G在細胞內的蓄積情況，采用不含糖PBS體系測定羅丹明6G在細胞內的吸收情況，采用含5％糖的PBS體系測定羅丹明6G

13、在細胞內的泵出情況。 結果顯示，胺碘酮對耐藥菌的增敏作用機制在于增加了藥物在細胞內的蓄積，這一作用是由藥物吸收增加而不是泵出減少引起的；胺碘酮對敏感菌細胞蓄積、吸收、泵出羅丹明6G的過程均無明顯影響。 六、藥物作用對白色念珠菌細胞形態(tài)的影響應用光學顯微鏡，在1000倍油鏡下觀察胺碘酮與唑類藥物對白色念珠菌耐藥株CA10、敏感株CA14形態(tài)學的影響。藥物作用6h的結果表明，細菌及組織染色方法大多數(shù)也可用于真菌細胞形態(tài)觀察。