新生隱球菌外分泌蛋白致病機(jī)制及新型藥物抗真菌作用研究.pdf

1、目的:新生隱球菌是臨床最常見(jiàn)的侵襲性病原真菌之一，可附著于活體植入材料表面形成生物膜結(jié)構(gòu)，從而顯著增強(qiáng)其對(duì)抗真菌藥物的耐藥性。本研究第一部分篩選鑒定了新生隱球菌生物膜態(tài)的3個(gè)外分泌差異蛋白，并初步論證其對(duì)隱球菌生物膜形成及毒力的功能影響。第二部分，我們將隱球菌金屬蛋白酶CnMpr1在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，和野生株比，CnMPR1表達(dá)株Sc獲得了穿越體外血腦屏障模型的能力，說(shuō)明CnMpr1可以獨(dú)立于透明質(zhì)酸-CD44等

2、其他途徑單獨(dú)在隱球菌穿越血腦屏障中其重要作用。在本部分研究中，我們擬利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)分析腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞潛在的與CnMpr1相互作用的受體蛋白。在第三部分的研究中，我們合成了不同直徑的銀包鈀納米片以檢測(cè)它們對(duì)各種主要侵襲性致病真菌的抑制作用。
　　方法:第一部分利用同源重組原理和基因槍技術(shù)構(gòu)建各差異蛋白的基因缺失株，結(jié)合生物膜表型檢測(cè)及細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索其對(duì)隱球菌生物膜形成與毒力的影響。第二部分我們利用免疫磁珠法提取hCME

3、C/D3細(xì)胞表面蛋白，通過(guò)與Sc（野生株作對(duì)照）共同孵育后提取蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測(cè)與分析。第三部分我們首先利用微量稀釋法測(cè)試不同直徑的銀包鈀納米片對(duì)各種深部致病真菌的抗真菌活性。隨后我們就銀包鈀納米片對(duì)新生隱球菌的抑菌作用及其作用機(jī)制進(jìn)行探究。
　　結(jié)果:第一部分中，體外生物膜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，較之標(biāo)準(zhǔn)株，vid△表現(xiàn)出顯著的生物膜形成能力的下降，同時(shí)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存率及對(duì)小鼠吸入感染模型的毒力顯著

4、減弱。第二部分蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，我們共發(fā)現(xiàn)79個(gè)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白與Sc的結(jié)合能力增強(qiáng)。第三部分我們成功合成了不同直徑的銀包鈀納米片，發(fā)現(xiàn)其對(duì)主要深部致病真菌特別是新生隱球菌具有明顯的抑制作用。銀包鈀納米片的抗真菌作用明顯優(yōu)于氟康唑，且接近兩性霉素B，而其溶血作用遠(yuǎn)小于兩性霉素B。銀包鈀納米片和兩性霉素B具有一定的聯(lián)合殺菌作用。新生隱球菌和銀包鈀納米片相互作用后，細(xì)胞膜的完整性遭到破壞，通透性明顯增加。
　　結(jié)論

5、:一、我們的研究首次發(fā)現(xiàn)外分泌蛋白Vid對(duì)新生隱球菌的生物膜形成以及致病感染具有重要的調(diào)節(jié)功能。二、與Sc相互作用的宿主蛋白質(zhì)中，將近三分之一的蛋白質(zhì)與細(xì)胞骨架和膜重排相關(guān);分別有16％的蛋白質(zhì)與代謝過(guò)程以及蛋白質(zhì)合成有關(guān);以及其他一些與細(xì)胞運(yùn)輸、免疫、蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們推測(cè)這些蛋白在隱球菌穿越血腦屏障過(guò)程以及與Mpr1的相互作用中起著重要作用。三、我們的研究首次發(fā)現(xiàn)銀包鈀納米片具有抗新生隱球菌作