新生隱球菌莢膜相關(guān)基因CAP10調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、新生隱球菌是少數(shù)致病真菌之一，不僅感染免疫抑制病人，也能感染免疫正常人群。主要感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最常見的是新生隱球菌性腦膜腦炎，約占隱球菌感染的80％。由于近年來艾滋病的流行及臨床上免疫抑制劑的大量應(yīng)用，新生隱球菌病的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢。 CAP10是近期才被分離的新生隱球菌莢膜相關(guān)基因。閱讀框含2081個(gè)bp，編碼582個(gè)氨基酸組成的蛋白，73kD大小，實(shí)驗(yàn)證明新生隱球菌丟失CAP10基因，其產(chǎn)莢膜能力喪失；使喪失產(chǎn)莢膜能

2、力的新生隱球菌莢膜缺陷株重新獲得CAP10基因后，其產(chǎn)莢膜能力恢復(fù)正常。動物實(shí)驗(yàn)也表明，CAP10基因是毒力所必需。另外發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子STE12α的正向調(diào)控。 分子和細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)中心問題是：順式作用DNA序列(啟動子、增強(qiáng)子)與反式作用因子如何協(xié)同控制基因的表達(dá)。這些相互作用是由轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物特異結(jié)合到上述序列上而介導(dǎo)的，這些元件位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游。目前尚未見有莢膜相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制對莢膜合成影響的報(bào)道。

3、 目的 對莢膜相關(guān)基因CAP10調(diào)控機(jī)制作更深入的研究，擬尋找具高啟動活性的調(diào)控序列位置，并探討糖類，藥物等對其作用的影響，以期對莢膜基因的形成及表達(dá)調(diào)控有更進(jìn)一步的了解，從而豐富對新生隱球菌致病機(jī)理的解釋，從另一個(gè)角度為抗新生隱球菌病的新藥及臨床治療的研究工作打下基礎(chǔ)。 研究方法與內(nèi)容 該課題共分為三個(gè)部分。 第一部分 用分子克隆的方法構(gòu)建了含有CAP10編碼區(qū)上游5'側(cè)翼序列不同長度片段的質(zhì)粒

4、重組體，通過基因報(bào)告系統(tǒng)篩選出了具啟動活性的CAP10上游啟動序列，從而為進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)；在這一部分中分別采用了兩種基因報(bào)告系統(tǒng)：Pcxj18質(zhì)?！湍副磉_(dá)系統(tǒng)及Pcat質(zhì)?！溉閯游锛?xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，以期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。兩種報(bào)告基因系統(tǒng)具體步驟如下： 1)Pcxj18質(zhì)?！湍副磉_(dá)系統(tǒng)：用分子克隆方法在Pcxj18質(zhì)粒上分別接入不同長度的CAP10基因編碼區(qū)上游5'側(cè)翼序列、CAT基因、TRP1的終止子序列，

5、構(gòu)建了重組質(zhì)粒Pcxjcats951，Pcxjcats500，Pcxjcats390，Pcxjcats303，Pcxjcats202，Pcxjcats102；用化學(xué)轉(zhuǎn)化法分別轉(zhuǎn)化酵母；轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定；進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的蛋白提取，紫外分光光度計(jì)蛋白定量，ELISA方法進(jìn)行CAT活性測定；所有測得的CAT值用蛋白濃度進(jìn)行校正，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計(jì)方法為各組間的方差分析； 2)Pcat質(zhì)?！溉閯游锛?xì)

6、胞表達(dá)系統(tǒng)：用分子克隆的方法在pCAT-enhancer載體質(zhì)粒(不含啟動子，但含有CAT報(bào)告基因)上接入不同長度的CAP10基因編碼區(qū)上游5'側(cè)翼序列，得到重組體Pcat951，Pcat500，Pcat390，Pcat303，Pcat202，Pcat102；用Fugene轉(zhuǎn)染試劑將這些重組體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至大鼠肝星狀細(xì)胞株(nFSC)中，ELISA法測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的CAT的表達(dá)水平并比較各重組體的啟動子活性。所有測得的CAT值用β-gal值與

7、蛋白濃度進(jìn)行校正，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計(jì)方法為各組間的方差分析。 第二部分 用不同濃度的葡萄糖、甘露糖、半乳糖，分別誘導(dǎo)第一部分中已證明具CAT表達(dá)活性的轉(zhuǎn)化子，用ELISA方法檢測CAT表達(dá)值，比較各組間CAT表達(dá)活性不同，以期比較三種不同糖類對新生隱球菌莢膜相關(guān)基因CAP10啟動活性的影響，闡述糖類在CAP10表達(dá)調(diào)控中的作用。與第一部分相同，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，仍采用兩種基因報(bào)告系統(tǒng)來進(jìn)行

8、實(shí)驗(yàn)。 第三部分用不同濃度的氟康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶，分別誘導(dǎo)第一部分中已證明具CAT表達(dá)活性的轉(zhuǎn)化子，用ELISA方法檢測CAT表達(dá)值，比較各組間CAT表達(dá)活性不同，以期比較幾種不同的抗真菌藥物對新生隱球菌莢膜相關(guān)基因CAP10啟動活性的影響。與第一部分相同，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，仍采用兩種基因報(bào)告系統(tǒng)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 研究結(jié)果 第一部分：結(jié)果表明Pcxjcatt951、Pcxjcatt500、Pcxjcat

9、t390、Pcxjcatt303的轉(zhuǎn)化子CAT表達(dá)量與Pcxjcatt202，Pcxjcatt102轉(zhuǎn)化子及陰性對照間存在顯著差異(P＜0.01)；Pcxjcatt202、Pcxjcatt102轉(zhuǎn)化子CAT表達(dá)量及陰性對照之間無顯著差異(P＞0.05)；Pcxjcatt951、Pcxjcatt500、Pcxjcatt390、Pcxjcatt303的轉(zhuǎn)化子CAT表達(dá)量間比較無顯著差異(P＞0.05)。 Pcat951、Pcat50

10、0、Pcat390、Pcat303的轉(zhuǎn)化子CAT表達(dá)量與Pcat202，Pcat102轉(zhuǎn)化子及陰性對照間存在顯著差異(P＜0.01)；Pcat202、Pcat102轉(zhuǎn)化子CAT表達(dá)量及陰性對照之間無顯著差異(P＞0.05)；Pcat951、Pcat500、Pcat390、Pcat303的轉(zhuǎn)化子CAT表達(dá)量間比較無顯著差異(P＞0.05)。 綜合兩種報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)得出的結(jié)果說明：含CAP10上游303bp，390bp，500bp

11、，951bp的轉(zhuǎn)化子有明顯的CAT表達(dá)活性，與陰性對照有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而含202bp，102bp的轉(zhuǎn)化子無明顯的CAT表達(dá)活性，與陰性對照無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第二部分：不同濃度的葡萄糖和甘露糖對轉(zhuǎn)化子CAT的表達(dá)強(qiáng)弱無明顯的影響，說明這兩種糖類對CAP10啟動活性無明顯的誘導(dǎo)作用。而不同濃度的半乳糖對轉(zhuǎn)化子CAT的表達(dá)強(qiáng)弱有明顯的影響，說明半乳糖對CAP10的啟動活性有明顯的誘導(dǎo)作用，而且這種正向誘導(dǎo)作用在實(shí)驗(yàn)所用的劑量范

12、圍內(nèi)具有劑量依賴關(guān)系。 第三部分：經(jīng)方差分析，在同一培養(yǎng)條件下不同濃度的氟康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶對轉(zhuǎn)化子CAT的表達(dá)強(qiáng)弱無明顯的影響，各濃度組間相比無顯著性差異(P＞0.05)。說明這三種抗真菌藥物對CAP10啟動活性無明顯的誘導(dǎo)作用。 結(jié)論 1.兩種CAT報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)——Pcxj18質(zhì)?！湍副磉_(dá)系統(tǒng)及Pcat質(zhì)粒——哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)均可用于新生隱球菌基因啟動子的篩選研究，實(shí)驗(yàn)證明兩者得出基本相同

13、的結(jié)論。 2.CAP10基因編碼區(qū)上游5'側(cè)翼端-303-0bp，-390-0bp，-500-0bp，-951-0bp均具明顯的啟動活性，各片段間啟動活性無明顯差異，-303bp-0bp是具完整啟動活性的最小單位。-202bp--303bp內(nèi)含CAP10啟動所必須的序列。 3.葡萄糖和甘露糖對CAP10啟動活性無明顯的誘導(dǎo)作用。半乳糖對CAP10的啟動活性有明顯的誘導(dǎo)作用，而且這種正向誘導(dǎo)作用在實(shí)驗(yàn)所用的劑量范圍內(nèi)具有劑