新生隱球菌ISC10基因的克隆及其表達(dá)的研究.pdf

1、新生隱球菌是一種重要的條件致病性真菌,主要存在于養(yǎng)鳥場或被鳥類排泄物污染的土壤中,在AIDS和HIV相關(guān)隱球菌病病人房子的灰塵和空氣中也能夠找到新生隱球菌的病原體。它常感染免疫低下或免疫缺陷的患者,從而引起臨床癥狀,甚至危及生命。新生隱球菌不同于人類的其它致病性真菌,它被一種多糖莢膜的動態(tài)組織結(jié)構(gòu)包裹著,具有能穿過和存活于哺乳動物免疫系統(tǒng)的特性,會在出芽生殖時(shí)經(jīng)歷其基因數(shù)量、大小和序列重組的改變。從核酸水平研究新生隱球菌的致病機(jī)理和病原

2、學(xué)特性,為隱球菌的診斷、治療和預(yù)防提供更加科學(xué)的依據(jù)。近30年來,不同的實(shí)驗(yàn)室建立了多個(gè)真核生物分子生物學(xué)模型系統(tǒng),例如啤酒酵母、裂殖酵母、構(gòu)巢曲霉等。這些模型系統(tǒng)的建立促進(jìn)了新生隱球菌分子生物學(xué)的發(fā)展。目前比較一致的有關(guān)隱球菌病的假說是,宿主可能是通過繁殖體的吸入而被感染,如吸入小的莢膜發(fā)育不良的酵母或在自然環(huán)境中有性繁殖產(chǎn)生的1-2μm的擔(dān)子孢子。擔(dān)孢子是隱球菌病的感染繁殖體,但由于對其體外復(fù)制和動物感染模型的研究還尚未成熟。盡管表

3、型特征明顯的新生隱球菌毒性因子已得到鑒定相關(guān)的基因也已克隆,但目前仍有一些可能的毒性因子及其作用未被發(fā)現(xiàn)。新生隱球菌ISC10基因是一個(gè)新的隱球菌基因產(chǎn)物。 ISC10基因是一種孢子形成所必需的蛋白質(zhì)。1993年,Kobayashi等從酵母中分離和鑒定出ISC2、ISC10兩種特異性基因,發(fā)現(xiàn)ISC2和ISC10在發(fā)生減數(shù)分裂作用后,都具有很強(qiáng)的出芽繁殖能力,并且證實(shí)ISC10基因的敲除可導(dǎo)致釀酒酵母形成孢子的能力下降。ISC1

4、O基因是從釀酒酵母標(biāo)本中分離出來的,在人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂7.5小時(shí)后產(chǎn)生的,在合成生殖細(xì)胞時(shí)起到重要作用。ISC10基因能合成穩(wěn)定磷酸纖維素,具有促成和維護(hù)、保養(yǎng)復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞的作用。研究顯示巨噬細(xì)胞對新生隱球菌的影響,會導(dǎo)致新生隱球菌的基因表達(dá)發(fā)生一定的改變,本實(shí)驗(yàn)室利用酵母基因芯片技術(shù)已篩選到新生隱球菌被巨噬細(xì)胞吞噬前后特異性表達(dá)的基因,ADK1、CYR1基因表達(dá)上升,而HSP70、ISC10等基因表達(dá)下降。ISC10基因表達(dá)下降與

5、新生隱球菌被巨噬細(xì)胞吞噬后,新生隱球菌的出芽率的下降有關(guān)。為進(jìn)一步深入研究ISC10基因與新生隱球菌的關(guān)系,必須先要克隆到新生隱球菌的ISC10基因。如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因,克隆再表達(dá),試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的,因?yàn)楂@取的DNA里面會含有非編碼區(qū)。要表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)出相應(yīng)的蛋白,只能通過提取其mRNA并進(jìn)行RT-PCR這條頗費(fèi)周折的途徑。RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的原理：是以總RNA或po

6、ly(A)+選擇性RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起,。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶,以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行,然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中,逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下,在一只管中順次進(jìn)行。 本課題通

7、過RT-PCR技術(shù)從新生隱球菌中克隆到與酵母出芽繁殖相關(guān)基因ISC10的全長cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建pGM-T vector重組質(zhì)粒,在大腸桿菌BL21 pLysS中的活性的表達(dá)。為后續(xù)研究新生隱球菌ISC10基因的表達(dá)調(diào)控及其潛在的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研究新生隱球菌的致病機(jī)制、毒性因子及其臨床治療提供了新的研究方向。 研究目的：利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),驗(yàn)證抽提得到的新生隱球菌mRNA是否具有多聚苷酸

8、(PolyA)尾現(xiàn)象。通過RT-PCR技術(shù)克隆到新生隱球菌酵母出芽繁殖相關(guān)基因ISC10的全長cDNA序列并對其核苷酸序列進(jìn)行分析。表達(dá)新生隱球菌ISC10基因,構(gòu)建pGM-T/ISC10重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受肽細(xì)胞中,研究新生隱球菌ISC10基因表達(dá)的活性。 研究方法：培養(yǎng)新生隱球菌野生株B3501,經(jīng)分離、活化后在對數(shù)生長期時(shí)收集菌體,加入裂解酶成功破除新生隱球菌細(xì)胞壁及外層莢膜。采用酵母RNA抽提試劑盒成功提取到新

9、生隱球菌總RNA,分離純化mRNA,利用RT-PCR方法,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。培養(yǎng)新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC32609、標(biāo)準(zhǔn)株BLS26、標(biāo)準(zhǔn)株BLS104、D2Y尿素酶陰性株(血清A型)等,在對數(shù)生長期時(shí)收集菌體。按酵母總RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit)方法提取新生隱球菌總RNA,經(jīng)鑒定后按cDNA第一鏈合成試劑盒(Quantscript RT Kit)方法合成cDNA第一鏈。依據(jù)釀酒

10、酵母ISC10基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物并合成。目的基因的PCR擴(kuò)增,并將所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,用以進(jìn)行氨基酸序列和及其生物信息學(xué)的分析。將編碼新生隱球菌ISC10基因的部分序列,克隆到表達(dá)載體pGM-T vector中構(gòu)建重組質(zhì)粒,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)在E.coli BI21(DE3)中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分別經(jīng)SDS·PAGE進(jìn)行檢測。 結(jié)果：提取新生隱球菌總RNA樣品中28S rRNA亮度都高于18S rRNA說明

11、提取過程中沒有降解現(xiàn)象發(fā)生,而且在經(jīng)DNase處理后電泳檢測中看不到DNA污染.經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測新生隱球菌D260/D280為1.79±0.05,說明RNA的純度較好。通過polyAT tract'mRNA分離系統(tǒng)分離得到的產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度法的濃度測定,均未檢測到mRNA的存在。以提取總RNA合成的cDNA為模板,P1、P2為引物,在擴(kuò)增條件、反應(yīng)體系相同的情況下,多次進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期的條帶大小一致

12、,片段大約782bp,編碼267個(gè)氨基酸殘基,分子量為31.65KD,編碼的蛋白質(zhì)在67位氨基酸由Ala(丙氨酸)突變?yōu)镻ro(脯氨酸),233位氨基酸由Thr(蘇氨酸)突變?yōu)镾er(絲氨酸)。含有1個(gè)起始密碼子,2個(gè)外顯子共18個(gè)氨基酸序列,C0901656、AW782246、CN581440、T17804為四個(gè)表達(dá)序列。所克隆的ISC10基因共編碼267個(gè)氨基酸,分子量為31.65KD,與GenBank中ISC10基因(DQ3322

13、12)序列同源性達(dá)99.10％。新生隱球菌ISC10基因中46個(gè)密碼子與LacZ基因(β-半乳糖苷酶)融合作用具有高度的相似性。編碼新生隱球菌ISC10基因的序列在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)獲得了表達(dá),含有表達(dá)載體pGM-T的大腸桿菌BI21(DE3)轉(zhuǎn)化子具有新生隱球菌的細(xì)胞活性。 結(jié)論：新生隱球菌總RNA內(nèi)無DNA污染；利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行的PCR產(chǎn)生多條帶,表明總RNA已經(jīng)被反轉(zhuǎn)錄(利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR條帶中還含

14、有rRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增帶);材料同時(shí)用Promega的mRNA純化系統(tǒng)進(jìn)行mRNA純化時(shí),分離系統(tǒng)進(jìn)行新生隱球菌的mRNA分離時(shí)幾次均未得到任何產(chǎn)物。通過RT-PCR反應(yīng)結(jié)果證明了新生隱球菌的mRNA不具有Poly(A)尾現(xiàn)象,為后續(xù)的基因克隆奠定基礎(chǔ)。利用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對新生隱球菌ISC10基因的克隆化及其鑒定,并分析了新生隱球菌ISC10基因的序列。經(jīng)基因序列比對發(fā)現(xiàn)了幾種具有高度同源性的菌株和與作為酵母菌中檢測啟動子Lac