新生隱球菌ISC10基因的克隆及其表達的研究.pdf

1、新生隱球菌是一種重要的條件致病性真菌,主要存在于養(yǎng)鳥場或被鳥類排泄物污染的土壤中,在AIDS和HIV相關隱球菌病病人房子的灰塵和空氣中也能夠找到新生隱球菌的病原體。它常感染免疫低下或免疫缺陷的患者,從而引起臨床癥狀,甚至危及生命。新生隱球菌不同于人類的其它致病性真菌,它被一種多糖莢膜的動態(tài)組織結構包裹著,具有能穿過和存活于哺乳動物免疫系統(tǒng)的特性,會在出芽生殖時經(jīng)歷其基因數(shù)量、大小和序列重組的改變。從核酸水平研究新生隱球菌的致病機理和病原

2、學特性,為隱球菌的診斷、治療和預防提供更加科學的依據(jù)。近30年來,不同的實驗室建立了多個真核生物分子生物學模型系統(tǒng),例如啤酒酵母、裂殖酵母、構巢曲霉等。這些模型系統(tǒng)的建立促進了新生隱球菌分子生物學的發(fā)展。目前比較一致的有關隱球菌病的假說是,宿主可能是通過繁殖體的吸入而被感染,如吸入小的莢膜發(fā)育不良的酵母或在自然環(huán)境中有性繁殖產(chǎn)生的1-2μm的擔子孢子。擔孢子是隱球菌病的感染繁殖體,但由于對其體外復制和動物感染模型的研究還尚未成熟。盡管表

3、型特征明顯的新生隱球菌毒性因子已得到鑒定相關的基因也已克隆,但目前仍有一些可能的毒性因子及其作用未被發(fā)現(xiàn)。新生隱球菌ISC10基因是一個新的隱球菌基因產(chǎn)物。 ISC10基因是一種孢子形成所必需的蛋白質。1993年,Kobayashi等從酵母中分離和鑒定出ISC2、ISC10兩種特異性基因,發(fā)現(xiàn)ISC2和ISC10在發(fā)生減數(shù)分裂作用后,都具有很強的出芽繁殖能力,并且證實ISC10基因的敲除可導致釀酒酵母形成孢子的能力下降。ISC1

4、O基因是從釀酒酵母標本中分離出來的,在人工誘導減數(shù)分裂7.5小時后產(chǎn)生的,在合成生殖細胞時起到重要作用。ISC10基因能合成穩(wěn)定磷酸纖維素,具有促成和維護、保養(yǎng)復層鱗狀上皮細胞的作用。研究顯示巨噬細胞對新生隱球菌的影響,會導致新生隱球菌的基因表達發(fā)生一定的改變,本實驗室利用酵母基因芯片技術已篩選到新生隱球菌被巨噬細胞吞噬前后特異性表達的基因,ADK1、CYR1基因表達上升,而HSP70、ISC10等基因表達下降。ISC10基因表達下降與

5、新生隱球菌被巨噬細胞吞噬后,新生隱球菌的出芽率的下降有關。為進一步深入研究ISC10基因與新生隱球菌的關系,必須先要克隆到新生隱球菌的ISC10基因。如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因,克隆再表達,試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的,因為獲取的DNA里面會含有非編碼區(qū)。要表達真核生物的基因并表達出相應的蛋白,只能通過提取其mRNA并進行RT-PCR這條頗費周折的途徑。RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)的原理：是以總RNA或po

6、ly(A)+選擇性RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起,。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶,以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行,然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中,逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優(yōu)化的條件下,在一只管中順次進行。 本課題通

7、過RT-PCR技術從新生隱球菌中克隆到與酵母出芽繁殖相關基因ISC10的全長cDNA序列并進行生物信息學分析,構建pGM-T vector重組質粒,在大腸桿菌BL21 pLysS中的活性的表達。為后續(xù)研究新生隱球菌ISC10基因的表達調控及其潛在的生物學功能奠定了基礎,也為進一步研究新生隱球菌的致病機制、毒性因子及其臨床治療提供了新的研究方向。 研究目的：利用反轉錄聚合酶鏈式反應,驗證抽提得到的新生隱球菌mRNA是否具有多聚苷酸

8、(PolyA)尾現(xiàn)象。通過RT-PCR技術克隆到新生隱球菌酵母出芽繁殖相關基因ISC10的全長cDNA序列并對其核苷酸序列進行分析。表達新生隱球菌ISC10基因,構建pGM-T/ISC10重組質粒,并轉化到大腸桿菌感受肽細胞中,研究新生隱球菌ISC10基因表達的活性。 研究方法：培養(yǎng)新生隱球菌野生株B3501,經(jīng)分離、活化后在對數(shù)生長期時收集菌體,加入裂解酶成功破除新生隱球菌細胞壁及外層莢膜。采用酵母RNA抽提試劑盒成功提取到新

9、生隱球菌總RNA,分離純化mRNA,利用RT-PCR方法,反轉錄合成cDNA模板進行PCR反應。培養(yǎng)新生隱球菌標準株ATCC32609、標準株BLS26、標準株BLS104、D2Y尿素酶陰性株(血清A型)等,在對數(shù)生長期時收集菌體。按酵母總RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit)方法提取新生隱球菌總RNA,經(jīng)鑒定后按cDNA第一鏈合成試劑盒(Quantscript RT Kit)方法合成cDNA第一鏈。依據(jù)釀酒

10、酵母ISC10基因的保守區(qū)序列設計引物并合成。目的基因的PCR擴增,并將所得PCR反應產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測,用以進行氨基酸序列和及其生物信息學的分析。將編碼新生隱球菌ISC10基因的部分序列,克隆到表達載體pGM-T vector中構建重組質粒,進行IPTG誘導在E.coli BI21(DE3)中表達,表達產(chǎn)物分別經(jīng)SDS·PAGE進行檢測。 結果：提取新生隱球菌總RNA樣品中28S rRNA亮度都高于18S rRNA說明

11、提取過程中沒有降解現(xiàn)象發(fā)生,而且在經(jīng)DNase處理后電泳檢測中看不到DNA污染.經(jīng)紫外分光光度計檢測新生隱球菌D260/D280為1.79±0.05,說明RNA的純度較好。通過polyAT tract'mRNA分離系統(tǒng)分離得到的產(chǎn)物,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度法的濃度測定,均未檢測到mRNA的存在。以提取總RNA合成的cDNA為模板,P1、P2為引物,在擴增條件、反應體系相同的情況下,多次進行PCR擴增結果與預期的條帶大小一致

12、,片段大約782bp,編碼267個氨基酸殘基,分子量為31.65KD,編碼的蛋白質在67位氨基酸由Ala(丙氨酸)突變?yōu)镻ro(脯氨酸),233位氨基酸由Thr(蘇氨酸)突變?yōu)镾er(絲氨酸)。含有1個起始密碼子,2個外顯子共18個氨基酸序列,C0901656、AW782246、CN581440、T17804為四個表達序列。所克隆的ISC10基因共編碼267個氨基酸,分子量為31.65KD,與GenBank中ISC10基因(DQ3322

13、12)序列同源性達99.10％。新生隱球菌ISC10基因中46個密碼子與LacZ基因(β-半乳糖苷酶)融合作用具有高度的相似性。編碼新生隱球菌ISC10基因的序列在大腸桿菌細胞內(nèi)獲得了表達,含有表達載體pGM-T的大腸桿菌BI21(DE3)轉化子具有新生隱球菌的細胞活性。 結論：新生隱球菌總RNA內(nèi)無DNA污染；利用隨機引物反轉錄產(chǎn)物為模板進行的PCR產(chǎn)生多條帶,表明總RNA已經(jīng)被反轉錄(利用隨機引物反轉錄產(chǎn)物的PCR條帶中還含

14、有rRNA反轉錄擴增帶);材料同時用Promega的mRNA純化系統(tǒng)進行mRNA純化時,分離系統(tǒng)進行新生隱球菌的mRNA分離時幾次均未得到任何產(chǎn)物。通過RT-PCR反應結果證明了新生隱球菌的mRNA不具有Poly(A)尾現(xiàn)象,為后續(xù)的基因克隆奠定基礎。利用逆轉錄PCR技術,實現(xiàn)了對新生隱球菌ISC10基因的克隆化及其鑒定,并分析了新生隱球菌ISC10基因的序列。經(jīng)基因序列比對發(fā)現(xiàn)了幾種具有高度同源性的菌株和與作為酵母菌中檢測啟動子Lac